背景

听力损失（HL）是最常见的感觉障碍之一，影响着全球近3.28亿成年人和3200万儿童。据估计，每年约有30,000名中国婴儿出生时患有先天性非综合征型耳聋（NSHL）。对于先天性或早发性HL，遗传因素被认为是主要病因，尤其是有家族史的。在遗传性病例中，大约70%是NSHL，其听力障碍是唯一的表型。据报道，近80%的NSHL病例为常染色体隐性遗传，具有较高的遗传异质性。常染色体隐性NSHL (ARNSHL)的主要症状为双侧对称、重度至极重度的、舌前感觉神经性耳聋，已知主要由单基因突变引起。

大多数患ARNSHL的家庭都有小谱系，有的为患病同胞对、有的为患病亲子对，有的只有一个患病孩子。尽管连锁分析在过去几十年中成功地绘制了大量的遗传疾病图谱，但与大型谱系相关的研究相比，有限世代的核心家系为遗传定位提供的信息较少，识别数量性状位点(QTL)的统计能力也较低。大量尚未解决的ARNSHL家庭迫切需要一种经济有效的方法来检测遗传病因。全外显子组测序(WES)的出现为探索极端异质性遗传疾病患者的致病突变提供了前所未有的机会，比如ARNSHL。

在本研究中，我们招募了具有相似表型的同胞对家系，并仅对每个家系的先证者进行WES（所谓的proband-WES），以寻找候选的致聋变异。随后，我们应用Sanger测序来验证在先证者的一级亲属中哪些变异与表型共分离。

方法和结果

变异的过滤

过滤掉低质量的变异（测序深度<10X，质量评分＜25，QualByDepth（Q/D）评分＜5）；

过滤掉ExAC、1000G、gnomAD数据库中次要等位基因频率（MAF）>1%的变异及ATCG数据库中等位基因频率> 0.5% 的变异；

然后通过搜索耳聋变异数据库中（DVD; http：//deafnessvariationdatabase.org/），OMIM数据库（http：//www.omim.org/）以及HGMD数据库（http：//www.hgmd.cf.ac.uk/ac/），关键词为“听力损失”或“耳聋”，生成耳聋相关基因列表（DAGL）。上述过滤后的变异根据是否出现在此列表中进行注释。在过滤后的变异中，所有纯合变异和假定的复合杂合变异均被选为候选致病变异。

结果

在本研究中，10X、30X和50X目标区域（外显子和剪接位点附近20bps内含子）的平均覆盖率分别为99% 、97% 和94% （补充表2）。

根据上述变异过滤标准，48.5%（16/33）的家系携带DAGL的纯合或复合杂合变异。所有检测到的变异都基于ACMG指南判定为P或LP，且符合表型-基因型共分离。在8个已知耳聋基因中检测到18种不同的变异。本研究检测到的已知耳聋变异基因为GJB2（MIM121011; 21.2% ）、TMPRSS3（MIM605551; 6.1% ）、MYO15A（MIM602666; 6.1% ）、TMC1（MIM606706; 3% ）、ADGRV1（MIM602851; 3% ）、PTPRQ（MIM603317; 3% ）、SLC26A4（MIM605646; 3% ）和OTOF（mim603681;3% ）（表一）。在这些变异中， 55.6% （10/18）为新变异，包括6个具有截断效应（无义、缺失、插入和剪接位点）的新变异，以及4个分别在TMPRSS3和MYO15A基因中检测到的错义变异。这些变异在200名非耳聋对照受试者中均未检测到。

在两个核心家系中分别鉴定了TMPRSS3基因中的一个新的纯合移码突变和一个新的纯合错义突变。两个患者都表现为先天性的、极重度的ARNSHL。TMPRSS3c.432delA（p.Q144fs）突变预测可通过破坏清道夫受体cysteinerich（SRCR）结构域和丝氨酸蛋白酶结构域来干扰蛋白质的空间结构。TMPRSS3 c.T551C（p.L184S）突变导致SRCR结构域中极其保守的位置的氨基酸被取代。3D分子模型显示，TMPRSS3c.432delA（p.Q144fs）突变通过影响SRCR和胰蛋白酶样丝氨酸蛋白酶结构域破坏了蛋白的空间结构；而对于TMPRSS3 c.T551C（p.L184S）突变，突变型丝氨酸与186位的组氨酸形成三个额外的氢键而结合，并与187位的丝氨酸形成一个额外的氢键而结合，这可能扰乱蛋白质结构（图2）。纯合突变c.432delA（p.Q144fs）和c.T551C（p.L184S）都发生在TMPRSS3蛋白的高度保守的SRCR结构域中，干扰了该跨膜蛋白激活ENaC钠通道并与细胞外分子相互作用的功能。

在MYO15A基因中检测到两个复合杂合突变，基因型如下：M21958家系中检测到c.A3833C（p.Q1278P）/c. G9876T（p.W3292C），HL1822家系中检测到c.G4351A（p.D1451N）/c.G6461A（p.C2154Y）。多重序列比对（MSA）表明，本研究检测到的MYO15A基因的4个变异均位于高度保守的位点。3个新变异：c.A3833C（p.Q1278P）、c.G6461A（p.C2154Y）和c.G9876T（p.W3292C）分别位于motor结构域、第一个MyTH4结构域和第二个FERM结构域（图3）。蛋白质模型显示，与野生型残基相比，疏水性脯氨酸取代了1278位的亲水性氨基酸，氢键数量减少了2个，这可能影响了相邻ATP结合口袋的功能。Motor结构域包括肌动蛋白和ATP结合位点，并作为分子动力学组成部分。MYO15A的motor结构域的3D结构模型显示，c.A3833C（p.Q1278P）突变通过减少氢键数量减弱了1278位的谷氨酰胺与其他氨基酸的相互作用，这可能对ATP水解和肌动蛋白结合稳定性有不利影响。对于c.G6461A（p.C2154Y）突变，2154位的半胱氨酸被具有较长侧链的酪氨酸取代，预测将增加两个额外的氢键。对于c.G9876T9（p.W3292C）突变，作为疏水氨基酸的3292位色氨酸被多个疏水氨基酸包围，在转变为半胱氨酸后会破坏疏水相互作用网络（图3）。

有趣的是，在HL1121家系中检测到ADGRV1基因的1个新的无义突变和1个新的移码突变构成复合杂合。无症状的父母分别携带1个ADGRV1杂合突变。ADGRV1突变与2C型Usher综合征相关。两个患病的同胞可能太年轻，还未出现视网膜变性和前庭功能障碍（表1）。

虽然本研究发现了几个新的候选耳聋基因，但在本研究中仅在单个家系中检测到。我们的结果表明，在进一步的研究中可能需要更大的样本量。

讨论

检测ARNSHL的致病突变具有挑战性，因为：1）家系规模小，世代有限，2）高临床和遗传异质性，3）由于大的人口流动性和低的近亲结婚率，导致很大一部分都为非复发性变异。因此，本研究旨在创建ARNSHL致病变异的检测策略，鉴定具有相似表型的各家系共有的新基因，并为已鉴定出致聋变异的个体提供遗传咨询和健康指导。

本研究在多个家系中检测到3个已知的耳聋基因（GJB2、TMPRSS3和MYO15A），提示proband-WES策略可成功应用于寻找表型相似的多个家族共有的新ARNSHL基因。但没有发现多个家族共有的新基因，这可能是由于样本量有限。因此，我们计划在未来扩大样本规模。此外，仍有一些家系尚未确定遗传病因，这可能是由于：1）环境因素或环境和遗传因素的组合效应; 2）位于内含子区域的变异或其他类型的变异超出了WES检测能力。

根据本研究的结果，proband-WES策略是一种经济有效的ARNSHL家系测试方法。因此，这种策略可以应用于听力诊所的许多ARNSHL患者，以得出基因诊断。获得HL的遗传诊断可以有很多好处，例如进行个体化健康指导、提供遗传咨询、评估HL的复发率、为产前诊断和植入前遗传诊断（PGD）提供详细信息，我们在之前的研究中已经验证了这一点。

结语

具有相似表型的ARNSHL患者可能具有相同的遗传病因，可通过proband-WES结合基于人群的研究进行鉴定。在本研究中，48.5% （16/33）的ARNSHL核心家系得到了分子诊断。即proband-WES策略可以很好地识别ARNSH家系的遗传病因，这是提供遗传咨询和个性化健康维护措施、预防耳聋基因传播的基础。