间接免疫荧光试验原理

将稀释的样本与生物载片（反应区内固定有包被基质的生物薄片）温育，特异性IgG、IgA或IgM抗体与相应的抗原结合。在第二次温育时，荧光素标记的二抗与抗原抗体结合物反应，形成特异性的荧光模型，通过荧光显微镜进行观察，判读结果。

实验操作常见问题

间接免疫荧光实验涵盖多个步骤，实验操作者会产生一些疑问，我们一起来看看经常遇到的问题有哪些：

步骤一：试剂盒平衡至室温、准备实验所需试剂及耗材

Q1：载片保存条件不当对实验结果会造成什么影响？

答：常规未开封的试剂盒应储存在2-8℃下。载片在平衡至室温后方可打开包装袋，避免因载片表面产生的冷凝水而破坏基质。载片保存不当，如：温度偏高时，可能加速抗原蛋白变性，破坏构象表位，导致抗体无法识别；湿度偏高时则有可能导致细胞吸水膨胀破裂；保存温度太低，载片可能被冷冻，导致载片脱落，细胞/组织变形。

Q2：实验当天多开封了1张载片，为了避免浪费，重新封口保存到4℃第二天再进行检测可以吗？

答：载片的保存对温度和湿度要求高，一经开封须尽快使用。如开封后未及时检测，无论如何封存，都会对实验结果产生影响，如荧光强度变弱、细胞轮廓模糊不清等。因此，建议在开始实验前先确认好样本的数量，正确选择合适人份数的载片进行检测。

步骤二：按说明书合理稀释样本后备用、试剂组分配制

Q3：实验当天的PBS-吐温缓冲液配制不够，可以直接用蒸馏水进行血清稀释吗？

答：稀释血清样本必须使用PBS-吐温缓冲液。用蒸馏水或纯水等稀释血清样本会导致细胞肿胀变形及荧光强度下降，影响结果判读。同样，用蒸馏水对载片进行冲洗也会导致细胞肿胀变形，或细胞出现空洞。

Tips：PBS-吐温缓冲液中所添加的吐温20是一种非离子型表面活性剂，对蛋白间的相互作用干扰较少，一般在固相免疫反应中用来阻断非特异性的蛋白吸附，可有效抑制蛋白吸附于固体表面，用于降低非特异性蛋白的结合，使背景更清晰，漏加了吐温20则会出现明显的非特异性荧光，细胞出现固缩融合现象。

步骤三：按顺序分别滴加稀释后样本与阴阳性对照/质控至加样板，开始温育

Q4：实验室温度较高使实验人员体感不舒适，可以在做实验时打开空调直吹吗？

答：实验过程中，不应该开启空调或风扇直吹载片，否则会加速温育过程中样本蒸发，出现异常结果。在进行实验时，应当确保实验室内温度与湿度都在建议范围内（室温18~25 ℃，湿度30%~50%）。

步骤四：温育后，用PBS-吐温缓冲液冲洗后浸入烧杯清洗

Q5：我担心沿载片边缘进行冲洗洗得不彻底，是否可以用细颈瓶对着基质区轻轻冲洗？

答：在进行载片的冲洗时应用大口烧杯盛PBS-吐温缓冲液（不能使用蒸馏水）流水快速沿载片边缘冲洗载片，而后立即将其浸入装有PBS-吐温缓冲液的洗杯中浸泡至少5分钟。使用任何工具（烧杯或细颈瓶等）直接冲刷基质区都可能导致基质的破损，影响结果判读。

步骤五：加入荧光二抗，二次温育

Q6：清洗后载片表面残留部分液体，我担心会稀释二抗的浓度，可以晾干五分钟后再加二抗吗？

答：欧蒙间接免疫荧光检测产品均使用疏水载片，这种设计可使载片不会因残留过多的液体而导致二抗被稀释，若将载片晾干再加入二抗，载片会因过度干燥导致异常的实验结果。

步骤六：温育后，用PBS-吐温缓冲液冲洗后浸入烧杯清洗

同Q5

步骤七：取出载片，吸干液体后进行封片并于显微镜下进行荧光判读

Q7：盖玻片第一次没盖好，可以掀起来重新盖吗？

答：载片覆盖上盖玻片后，应立即检查是否吻合好，如需要重新调整位置，可以将载片重新放入PBS-吐温缓冲液中，待两者分离后取出重新封片，如直接掀起盖玻片可能会导致基质的损坏，从而影响结果判读。

总结

除了上述情况外，常见的异常实验结果还包括：因实验用水不合格导致的背景发绿、因封片介质过量或镜头污染导致的镜下视野模糊不清以及因温育后载片暴露在阳光直射处导致的荧光强度减弱等情况。

间接免疫荧光法在自身抗体检测中通过对荧光模式和滴度的分析，辅助判断疾病的活动性和评估疾病的严重程度，助力精准治疗方案的制定。其操作的规范性和准确性对于确保检测结果的可靠性至关重要，正确且合理地完成实验流程能避免绝大部分异常检测结果的发生，从而为临床诊断和治疗提供有力支持。