2025年11月6日，清华大学王海峰，颉伟和中国科学院生物物理研究所方显杨共同通讯在Nature Biotechnology 在线发表题为“CRISPR live-cell imaging reveals chromatin dynamics and enhancer interactions at multiple non-repetitive loci”的研究论文，该研究介绍CRISPR PRO-LiveFISH（基于正交碱基的聚合引导RNA活细胞荧光原位杂交技术），该技术结合扩展遗传字母系统中的正交碱基与合理设计的单向导RNA（sgRNA），可在活细胞中高效标记多个非重复基因座。
经优化的方法可同时成像多达六个基因组位点，且仅需使用10条sgRNA即可实现非重复基因座的成像而无需信号放大。作者在多种细胞类型（包括原代细胞）中验证了此方法，并应用其揭示了增强子-启动子动态变化及基因组动态与表观遗传状态之间的相关性。此外，作者还发现PCDHα基因座与增强子的交互作用可能在其空间移动过程中持续存在，且BRD4蛋白可维持调控癌细胞中MYC癌基因表达的超增强子接触。CRISPR PRO-LiveFISH可广泛应用于活细胞染色质动态及基因组组织结构的相关研究。
表观遗传修饰与三维染色质组织结构在调控细胞活动及决定细胞命运中发挥关键作用。增强子作为一类顺式调控DNA元件，通过增强子-启动子（E-P）交互作用促进多种细胞类型特异性基因的转录。基于测序的研究方法已揭示不同细胞类型和组织中三维基因组结构与表观遗传修饰存在的显著差异，而荧光原位杂交（FISH）技术的进步使得复杂染色质结构的可视化成为可能。
然而，这些方法通常仅限于固定样本，导致对实时染色质动态的理解存在重要空白。例如，表观遗传变化如何与不同细胞类型的基因组动态相关联，以及E-P交互作用是持续性还是瞬态性，目前仍不明确。尽管多项研究强调了E-P交互作用在基因调控中的核心作用，但近期成像研究表明哺乳动物细胞中的环状交互作用具有瞬态或动态特性。此外，蛋白质因子在调控实时E-P动态中的作用仍亟待探索。因此，开发有效的多重DNA成像工具以研究时空基因组动态（如E-P交互作用）具有重要意义。
传统的活细胞DNA成像方法需在基因组中插入LacO或TetO等DNA序列，操作耗时费力。CRISPR-Cas系统的应用实现了活细胞内源性DNA位点的可编程可视化。然而，由于系统复杂性、检测灵敏度欠佳和/或特异性受到了影响，在大多数CRISPR成像系统中实现对非重复基因座的多位点成像仍面临挑战。例如，基于荧光dCas9的DNA编码成像系统为标记单个非重复基因座，通常需要表达20-70个向导RNA（gRNA），且往往涉及复杂的DNA编码构建体及多组分的精确基因表达调控。CAS-LiveFISH虽可在体外将荧光dCas9与单链向导RNA（sgRNA）组装，但存在高背景、潜在串扰风险，并且需要超过200个sgRNA才能实现非重复基因座成像。在基于sgRNA的DNA编码成像系统中，虽有研究报道通过信号放大实现单个sgRNA成像，但近期研究指出非靶向sgRNA扩增可能产生非特异性信号。此外，不同基因座的多色成像需要正交成像系统，这进一步增加了递送和精细调控的复杂性。因此，在遗传操作更为复杂的原代细胞中实现高效可靠的非重复基因座多色活细胞成像仍具挑战性。
作者此前开发的基于试剂的CRISPR LiveFISH技术通过利用gRNA固有稳定性开关的独特优势，提升了信噪比，实现了多重活细胞基因组成像。该方法采用与dCas9蛋白组装的染料标记荧光gRNA标记基因组靶点，其中靶点结合型gRNA比未结合型具有更高稳定性，从而改善信噪比。尽管CRISPR LiveFISH已成功应用于基因编辑、染色体易位和RNA转录研究，但其对重复序列的适用性限制了对大多数非重复编码基因及调控元件的研究。
本研究开发了CRISPR PRO-LiveFISH技术，该技术整合扩展遗传字母技术中的正交碱基应用与合理化sgRNA设计，实现了活细胞中非重复基因组区域的追踪及E-P动态的多重成像。CRISPR PRO-LiveFISH表现出高效性能，仅需10个sgRNA即可实现非重复基因座成像。该技术支持最多六个不同基因座的多重成像，并可在包括原代细胞在内的多种细胞类型中发挥作用。通过应用CRISPR PRO-LiveFISH，本研究揭示了基因组动态与表观遗传状态之间的相关性，证明了基因-增强子交互作用在空间移动性存在下的持续性，并为BRD4在维持MYC癌基因与其超级增强子之间的交互作用及调控肿瘤细胞中致癌转录的关键作用提供了活细胞证据。这些发现表明CRISPR PRO-LiveFISH是研究活细胞染色质动态的有效工具。
清华大学生命科学学院王海峰研究员、颉伟教授以及中科院生物物理所方显杨研究员是本文的共同通讯作者。清华大学 2019 级博士生刘美铄、2022 级博士生黄可韵和 2020 级博士生张杰（已毕业）为共同第一作者。西湖大学于洪涛教授、戚树涛研究员，清华大学博士后杜振海（现中科院分子细胞科学卓越创新中心研究员），以及清华大学 2019 级博士生胡梁俊（已毕业）、2021 级博士生李青阳、2022 级博士生王新铭、2021 级博士生顾卜铭、2023 级博士生唐昊、2021 级博士生马宇等对研究做出重要贡献。研究工作得到农业农村部项目、国家重点研发计划、国家自然科学基金、中科院战略性先导科技专项、北京市自然科学基金、清华 — 北大生命科学联合中心、疑难重症及罕见病全国重点实验室自主研究课题、清华大学自主科研计划、本源公益基金、新基石科学基金等项目的支持。
原文链接：
https://www.nature.com/articles/s41587-025-02887-3