2025年7月29日，安徽大学陈学敏和美国国立卫生研究院杨薇，Martin Gellert共同通讯在PNAS（IF=9.4）在线发表题为“How RAG1/2 evolved from ancestral transposases to initiate V(D)J recombination without transposition”的研究论文。该研究通过冷冻电镜（cryo-EM）解析了近全长RAG1/2与切割后重组信号序列（RSS）形成的信号末端复合物（SEC）结构，分辨率达2.95 Å。
SEC-0和SEC-Plant同源结构域（PHD）两种关键结构揭示了RAG2（Transib转座酶中缺失的组分）的独特调控作用：SEC-0呈现闭合构象，证实核心RAG2通过"弹簧加载"机制稳定RSS切割状态，从而促进顺序性DNA切割；SEC-PHD则阐明ProtoRAG中缺失的RAG2非核心PHD和酸性铰链区（AH）如何抑制转座过程中的靶DNA结合。虽然组蛋白H3K4me3可招募RAG1/2至RSS位点，但不会影响其与RSS侧翼V、D或J基因片段的结合。值得注意的是，被抑制的转座活性可被H3K4me3肽段激活，该肽段能解除PHD的抑制作用。但体内实现这种去抑制需要两个核小体以极近间距（约180°弯曲） flanking靶DNA的特殊构型。作者的结构与生化研究阐明了RAG1如何通过获得RAG2组分，并利用其核心与非核心结构域协同增强V(D)J重组同时抑制转座活性。
V(D)J重组是适应性免疫系统产生多样性和特异性以中和多种病原体的关键过程。重组激活基因1/2（RAG1/2）蛋白是由两个RAG1和两个RAG2亚基组成的异源四聚体，通过先在重组信号序列（RSS）边界处形成切口继而产生发夹结构的方式，切割抗原受体V、D、J基因片段侧翼的DNA。随后，产生的平末端信号端和发夹末端基因片段（又称编码侧翼）分别通过非同源末端连接（NHEJ）进行重新连接。RAG的核心结构域和非核心结构域分别负责DNA切割和V(D)J重组的调控。
RAG1具有一个RNase H样（RNH）催化核心结构域（氨基酸384-1008）。与所有含RNH的转座酶（从细菌Tn5、MuA、果蝇P元件到真核生物Hermes及逆转录病毒整合酶类似），RAG1/2催化核心不仅能在RSS处切割，还可在体外将两个切割的RSS末端作为转座子末端的末端反向重复序列（TIR）插入富含GC的5 bp靶位点。然而，具有潜在危害性的RAG1/2转座作用在体内受到抑制。RAG2在包括Transib在内的相关转座酶中不存在。除核心结构域（氨基酸1-387）外，仅存在于有颌脊椎动物而在原RAG的ProtoRAG2中缺失的调控性植物同源结构域（PHD，氨基酸410-485）和酸性铰链区（AH，氨基酸388-409）已被报道可抑制转座作用。RAG2 PHD还通过结合组蛋白H3K4me3尾部，将RAG1/2招募至开放染色质上的V、D、J基因片段。有趣的是，PHD还能适度自抑制RSS DNA切割，而21个氨基酸的H3K4me3肽段可解除这种抑制。
小鼠apo-RAG1/2（mRAG）是最早确定的核心RAG结构。随后，关于mRAG、斑马鱼zRAG、Transib和ProtoRAG的RSS DNA结合、切割甚至切割后将RSS转座至靶DNA（tDNA）的结构相继被报道。从DNA结合（预反应复合物PRC）、切口形成复合物（NFC）到发夹形成复合物（HFC），RAG及相关重组酶在DNA切割过程中经历了两半部分从开放到闭合的构象变化。mRAG在链转移复合物（STC）中保持相同的闭合构象，其中tDNA在5 bp靶位点5′-CGCCG-3′内相隔3 bp处发生两次85°弯曲（总计170°），并进一步发生平面外扭曲。tDNA的严重变形可能阻碍RAG介导的转座，并促进强烈解离使STC恢复为信号端复合物（SEC）和tDNA。
目前尚未解析与切割后RSS信号端（不含编码侧翼）结合的核心RAG复合物（SEC）结构，且尚不清楚mRAG SEC是保持闭合还是像仅与切割TIR结合的Transib一样变为开放构象。在V(D)J重组结构研究中加入RAG2 PHD时，总是需要添加组蛋白H3K4me3肽段以激活DNA切割。因此，目前已报道的所有RAG结构中，PHD和其他非核心结构域均呈无序状态。已报道的zRAG SEC结构与HFC相似，因其编码侧翼结合位点被预切割RSS DNA占据而非空置。RAG2 PHD如何抑制RSS DNA切割和转座仍不清楚。
该研究在无H3K4me3肽段条件下，用近全长蛋白和预切割RSS DNA组装了mRAG SEC，通过冷冻电镜解析了最高2.95 Å分辨率的结构，鉴定出真正的SEC（SEC-0）和PHD结合的SEC（SEC-PHD）。这些结构阐明了RAG2如何支持"弹簧加载"式RSS-DNA切割并抑制非预期转座作用。
原文链接：
https://doi.org/10.1073/pnas.2512362122