背景：基于血液的液体活检技术能够无创地表征多种癌症，现有应用包括早期检测、组织来源(TOO)分类、基因分型和疾病监测。这些应用主要集中于循环肿瘤DNA(ctDNA)，例如在晚期恶性肿瘤患者中广泛用于无创肿瘤基因分型。而循环RNA(cfRNA)分析作为ctDNA分析的有效补充，有助于实现更广泛的癌症分子特征描述。但绝大多数循环转录本来自造血细胞，这使得罕见循环肿瘤RNA(ctRNA)分子的检测极具挑战性。

方法：本研究建立的RARE-seq(Random priming and affinity capture of cfRNA fragments for enrichment analysis by sequencing，随机引物扩增与cfRNA片段亲和捕获的测序富集分析)是专为cfRNA分析优化的方法。该方法通过以下步骤提升检测性能：①预分析优化：评估血液采集、RNA提取及储存条件对cfRNA的影响，分析离心速度对血小板污染水平的影响。②实验流程改进：优化DNA去除、cDNA合成及末端修复步骤，提升低丰度cfRNA输入下的文库制备效率，并减少cfDNA干扰。③数据分析：通过基因集富集分析(GSEA)比较cfRNA与白细胞RNA的表达差异，识别 cfRNA 中富集的非造血细胞来源转录本 (如内皮细胞、肝细胞相关转录本) 及血小板相关转录本。

结果：①高灵敏度检测：RARE-seq对肿瘤来源cfRNA的检测灵敏度比全转录组RNA测序(RNA-seq)高约50倍，检测限达0.05%。对369名癌症患者、非恶性疾病患者及健康对照者的437份血浆样本进行分析，发现在非小细胞肺癌患者血浆样本中cfRNA检测敏感性随疾病分期升高(I期30%→IV期83%)，且优于肿瘤来源未知的ctDNA分析。②临床应用验证：在EGFR突变NSCLC患者中，RARE-seq可同时检测组织学转化和突变耐药机制。成功应用于肿瘤组织来源判定、良性肺疾病评估及mRNA疫苗接种反应监测。③血小板干扰控制：血小板转录本在 cfRNA 中显著富集且离心速度降低会导致血小板污染增加(1,200g vs. 2,500g离心时，血小板来源 cfRNA 的浓度差异达 7.5 倍)。

结论：RARE-seq通过优化样本处理、靶向富集和算法校正，为癌症诊断、治疗监测和精准医学提供了革新性技术支撑，展现了作为多用途液体活检工具的临床潜力。

原文信息

An ultrasensitive method for detection of cell-free RNA

作者信息

第一作者：Monica C. Nesselbush

通讯作者：Ash A. Alizadeh & Maximilian Diehn

通讯作者单位：Stanford Cancer Institute, Stanford University, Stanford, CA, USA.

DOI: 10.1038/s41586-025-08834-1