1、什么是ctDNA？
ctDNA是肿瘤细胞在凋亡、坏死或主动分泌过程中释放到血液循环中的游离DNA片段，长度132~145 bp，半衰期较短（一般<2 小时）。ctDNA直接来源于原发灶或转移灶的肿瘤细胞，携带与肿瘤一致的基因组变异（如点突变、融合基因、甲基化修饰等）。ctDNA检测的主要样本来源为外周血，其他如脑脊液、胸腔积液、尿液等也可作为检测来源。ctDNA检测在肿瘤组织标本获得困难或需动态监测治疗反应、微小残留病灶（MRD）以及早期复发时具有重要临床价值。
2、ctDNA的检测方法
ctDNA检测方法主要包括采用聚合酶链式反应（PCR）和测序技术。基于PCR的检测方法包括液滴数字聚合酶链式反应（ddPCR）法和油包水乳液中微粒子上的单分子PCR法，即BEAMing技术。基于测序的检测方法主要包括5种：标记扩增深度测序（TAm-Seq）法、深度测序肿瘤个体化建档法（CAPP-Seq）、全外显子组测序法（WES）、全基因组测序法（WGS）、全基因组甲基化测序（WGBS-Seq）。
3、ctDNA在儿童实体肿瘤中的临床应用
ctDNA在儿童实体肿瘤中应用广泛，主要在肿瘤早期诊断和治疗、评估治疗反应、MRD监测和早期复发监测、评估肿瘤获得性耐药机制等发挥重要作用。
3.1 神经母细胞瘤
多项研究证实，ctDNA检测技术在高危神经母细胞瘤（NB）的分子特征分析中展现出显著优势。Bosse Kristopher R团队对48例高危NB的167份血液样本进行了ctDNA测序分析，在56%的样本和73%的可评估患者中，至少检测出一种致病性基因组变异，最常见ALK和TP53中的错义变异，其次是MYCN扩增和BRAF基因变异。值得注意的是，在原发性肿瘤组织与ctDNA的对比研究中，19例患者诊断时检测到ctDNA与原发灶共享41%的单核苷酸变异（SNV）和93%的拷贝数变异（CNV），其中MYCN扩增、1p缺失、11q缺失和17q扩增等CNV事件呈现高度一致性，而SNV差异则揭示了肿瘤克隆异质性特征以及ctDNA的全面性。
Ida Rahmqvist团队对13例NB患儿的136例血浆进行ctDNA分析发现，ctDNA检测灵敏度显著优于传统生物标志物：相较于神经元特异性烯醇化酶（NSE）和尿香草扁桃酸（HVA）/高香草酸（VMA）在正常值至100倍参考上限的波动范围，ctDNA浓度可达到参考上限的104-106倍。1例患者的3次复发事件中，ctDNA均早于临床复发（其中1次较影像学确认提前78天）呈现上升趋势，且检测到与原发灶一致的多个SNV。该研究发现NB高危组诊断时ctDNA水平显著高于非高危组，且与肿瘤DNA的变异等位基因频率高度相关，提示其具有优化现有危险度分层体系的潜力。
ctDNA可精准评估治疗反应：Bosse Kristopher R团队对16例NB患者进行连续ctDNA检测，其中15例（93.8%）的突变频率与影像学及代谢标志物（尿HVA/VMA）变化高度吻合。Ida Rahmqvist团队进一步发现，无论高危或非高危NB患者，治疗有效者ctDNA水平均呈进行性下降，维持治疗期间持续阴性者无进展生存期显著延长，证实其预后预测价值。
在克隆进化及耐药机制研究方面，Chicard Mathieu团队通过深度靶向测序发现19例复发NB中ctDNA特异性SNV均来源于原发灶次要亚克隆，展现了治疗压力导致的克隆选择现象。Bosse Kristopher R团队对15例接受ALK抑制剂治疗患者的ctDNA动态监测同样揭示基因组进化特征。现有证据表明，ctDNA检测不仅能实现NB的早期分子诊断、早期复发预警，还可通过动态监测揭示肿瘤克隆演变规律，为个体化治疗策略制定提供关键依据。其在危险度分组、微小残留病灶监测和耐药突变研究方面的应用，有望推动NB治疗进入精准诊疗新时代。
3.2 横纹肌肉瘤
De Traux de Wardin, Henry团队对10例横纹肌肉瘤（RMS）患儿进行ctDNA分析，诊断时ctDNA对融合阳性（FP-RMS）患者的PAX3::FOXO1的检出率达100%（6/6），可同步检测SNV（2/2患者）及CNV（4/5患者），成功捕获原发肿瘤的RB1、PIK3CA和CDKN2A等关键驱动变异。对于FP-RMS复发患者，86%（6/7）检出PAX3::FOXO1融合，67%（4/6）检出CNV（包括CDKN2A缺失及MDM2/MYCN扩增），67%（2/3）检出SNV。而对于融合阴性（FN-RMS）患者，ctDNA在100%样本中至少检出一种变异，展现了广谱检测潜力。该研究表明融合片段数量与疾病负荷呈正相关，复发及终末期融合片段数量显著增加。Ruhen团队发现预后较差的RMS患者中ctDNA水平较高，并且在随访期间与肿瘤负荷相关。ctDNA检测可覆盖FP-RMS和FN-RMS的分子特征（融合基因、SNV、CNV），在诊断分型、复发监测及治疗反应动态监测中均展现高敏感性。其与疾病负荷的强相关性为个体化治疗调整及预后评估提供了关键分子依据。
3.3 尤文肉瘤
ctDNA能够通过尤文肉瘤（EWS）患者外周血检测到EWSR1融合变异， Schmidkonz等研究证实化疗后患者的ctDNA 88%实现完全缓解，提示其作为疗效动态监测指标的潜力。Krumbholz团队对102例EWS患者的纵向分析表明，化疗后ctDNA持续阳性是无事件生存期和总生存期缩短的独立危险因素。多个研究通过NGS、ddPCR和CAPP-Seq技术进一步验证了ctDNA水平与肿瘤负荷、转移状态及预后的强相关性，提示ctDNA可能作为EWS肿瘤负荷动态监测的潜在指标，同时也可能为评估治疗反应及预测患者生存预后提供参考依据。
3.4 其他实体肿瘤
研究者对50例Ⅲ/Ⅳ期肾母细胞瘤患者的血清及尿液ctDNA进行超低深度全基因组测序与靶向panel测序分析，发现血清ctDNA与肿瘤组织突变一致性较高（1q获得70%、16q LOH 88%、1p LOH 70%），且血清ctDNA阳性患者4年无事件生存率（EFS）呈降低趋势。ctDNA检测不仅有助于揭示肿瘤异质性特征，其在肾母细胞瘤风险分层评估及预后判断中的潜在应用价值也值得关注。
Mattox等人通过分析神经纤维瘤、丛状神经纤维瘤及恶性外周神经鞘膜瘤（MPNST）患者血液ctDNA的非整倍体特征，联合亚染色体拷贝数变异分析后，灵敏度提升至50%。该研究为区分丛状神经纤维瘤恶性转化提供了潜在分子标志。还有研究者通过分析中枢肿瘤患者（室管膜瘤、髓母细胞瘤等）的脑脊液动态追踪循环ctDNA，发现化疗后ctDNA下降与影像学缓解同步，提示ctDNA水平与疾病进展及治疗反应显著相关，但存在假阴性风险，仍需更多研究进一步验证。
4、ctDNA的优势与局限性
ctDNA检测的优势主要体现在其无创性、动态性和全面性。通过外周血等体液即可无创或微创获取样本，避免传统组织活检的创伤风险，尤其适用于无法手术或需长期监测的患者；其高灵敏度技术（如ddPCR、NGS）可实时追踪肿瘤基因组动态变化，早期发现微小残留病灶或耐药突变，指导精准治疗调整，同时整合全身肿瘤释放的DNA片段，克服组织活检的时空异质性局限。
然而，ctDNA检测仍面临显著挑战：血液中ctDNA丰度极低（尤其在早期或低负荷肿瘤中），对检测灵敏度要求苛刻；正常细胞游离DNA背景干扰可能掩盖肿瘤信号，需依赖分子条形码（UMI）和生物信息学去噪；此外，技术标准化不足、成本较高以及无法提供肿瘤微环境的空间信息（如免疫细胞浸润）等问题限制了其临床普及。未来通过多组学整合（突变+甲基化+片段组学）和单分子测序技术优化，有望突破瓶颈，推动ctDNA在癌症早筛、疗效评估及复发预警中的广泛应用。
参考文献
1、 Bosse, Kristopher R et al. Serial Profiling of Circulating Tumor DNA Identifies Dynamic Evolution of Clinically Actionable Genomic Alterations in High-Risk Neuroblastoma. Cancer discovery vol. 12,12 (2022): 2800-2819.
2、Rahmqvist, Ida et al. Personalized circulating tumor DNA analysis for sensitive disease monitoring and detection of relapse in neuroblastoma. Biomarker research vol. 12,1 148. 26 Nov. 2024.
3、Lodrini, Marco et al. Targeted Analysis of Cell-free Circulating Tumor DNA is Suitable for Early Relapse and Actionable Target Detection in Patients with Neuroblastoma. Clinical cancer research : an official journal of the American Association for Cancer Research vol. 28,9 (2022): 1809-1820.
4、Abbou, Samuel et al. Circulating Tumor DNA Is Prognostic in Intermediate-Risk Rhabdomyosarcoma: A Report From the Children's Oncology Group. Journal of clinical oncology : official journal of the American Society of Clinical Oncology vol. 41,13 (2023): 2382-2393.
5、Smolle, Maria Anna et al. Precision medicine in diagnosis, prognosis, and disease monitoring of bone and soft tissue sarcomas using liquid biopsy: a systematic review. Archives of orthopaedic and trauma surgery vol. 145,1 121. 11 Jan. 2025.
6、de Traux de Wardin, Henry et al. Sequential genomic analysis using a multisample/multiplatform approach to better define rhabdomyosarcoma progression and relapse. NPJ precision oncology vol. 7,1 96. 20 Sep. 2023.