2025年5月7日，美国麻省理工学院张锋团队在Nature Biotechnology（IF=33.1）在线发表题为“Evolution-guided protein design of IscB for persistent epigenome editing in vivo”的研究论文，该研究开发了用于体内持久表观基因组编辑的IscB进化用于指导蛋白质设计。
在这里，研究人员通过结合直向同源筛选、结构指导的蛋白质结构域设计和RNA工程以及基于深度学习的结构预测，设计了紧凑的专性可动因子指导活性(OMEGA) RNA指导的核酸内切酶IscB及其指导RNA (ωRNA),以产生改进的变体NovaIscB。研究发现紧凑的NovaIscB在人类基因组上实现了高达40%的indel活性(比野生型OgeuIscB提高了约100倍),相对于现有的IscB具有更高的特异性。进一步表明，NovaIscB可以与甲基转移酶融合，产生可编程转录阻遏物OMEGAoff，它足够紧凑，可以包装在单个腺相关病毒载体中，用于持续的体内基因阻遏。这项研究强调了将天然多样性与蛋白质工程相结合来设计用于分子生物学应用的增强型酶的力量。
另外，2025年2月27日，博德研究所张锋团队在Science 在线发表题为“TIGR-Tas: A family of modular RNA-guided DNA-targeting systems in prokaryotes and their viruses”的研究论文，该研究从Cas9的引导RNA相互作用域开始，通过迭代的结构和序列同源性挖掘，在噬菌体和寄生细菌中鉴定了一个RNA引导的DNA靶向蛋白家族。每个系统由串联间隔引导RNA （TIGR）阵列和含有Nop结构域的TIGR相关（Tas）蛋白组成，有时融合到HNH （TasH）或RuvC （TasR）核酸酶结构域。该研究发现TIGR阵列被加工成36-nt RNA (tigRNAs)，通过串联间隔器靶向机制直接序列特异性DNA结合。TasR可以被重新编程以进行精确的DNA切割，包括在人类细胞中。TasR的结构显示出与盒C/D snoRNPs和IS110 RNA引导转座的惊人相似性，为了解各种RNA引导系统的进化提供了见解。
2025年2月18日，博德研究所张锋团队在Cell在线发表题为“Reprogrammable RNA-targeting CRISPR systems evolved from RNA toxin-antitoxins”的研究论文，该研究描述了一种整合的序列/结构进化追踪方法来识别RNA靶向CRISPR-Cas13系统的祖先。研究发现Cas13可能由AbiF进化而来，AbiF由一个与保守的非编码RNA (ncRNA)稳定相关的流产感染连锁基因编码。进一步描述了一个微型Cas13的特征，在这里分类为Cas13e，它是AbiF和其他已知Cas13s之间的进化中间体。尽管有这种关系，但它们的功能有很大的不同。Cas13e是一种RNA导向的RNA靶向系统，而AbiF是一种具有RNA抗毒素的毒素-抗毒素(TA)系统。使用冷冻电镜镜(cryo-EM)解析了AbiF的结构，揭示了使Cas13s与AbiF不同的基本结构变化。最后，绘制了使非导向TA系统进化成RNA导向CRISPR系统的关键结构变化。
天然可编程酶已经改变了研究和治疗复杂疾病的能力。RNA引导系统的应用和工程，最显著的是CRISPR-Cas9，加速了发现疾病遗传基础的遗传筛选方法，实现了精确的细胞和动物疾病模型的生成，并产生了在临床上治疗遗传疾病的新疗法。
扩展可重编程基因组编辑器的治疗应用需要开发高效和特异的系统，可以安全和精确地传递到靶细胞类型。自从最初将化脓性链球菌CRISPR–Cas 9(SpCas9)用于哺乳动物基因组编辑以来，基因组挖掘、理性诱变和结构导向蛋白质设计以及定向进化方法已经产生了具有改进的活性、特异性和大小的新系统。然而，在保持特异性的同时平衡增强的活性仍然是一个突出的挑战，并且还迫切需要紧凑的基因组编辑工具以促进体内递送，特别是整合了其他功能域(如转录激活子和阻遏子)的工具，从而产生难以递送的大构建体。
最近发现的专性可动因子导向活性(OMEGA)系统是一类独特的小型RNA导向核酸酶，能够在人类细胞中进行靶向基因组编辑。Cas9的祖先OMEGA-IscB是基因组和表观基因组编辑的特别引人注目的候选物，因为它的尺寸小(~ 300-550个氨基酸(aa))，这使得它更有利于通过腺相关病毒(AAVs)递送；其双核酸酶组成，能够控制哪些DNA链被切割；和它的大结构指导RNA (ωRNA)，它提供了支架额外相互作用的界面。此外，OMEGA–IscB与双链DNA(dsDNA)结合形成的开放且可接近的R环，使双链无断裂应用成为可能，如碱基编辑。然而，与使用更长引导序列(~ 17–20 BP)的SpCas9相比，IscBs的特异性可能较低，因为它们的有效引导序列较短(~13 bp)。
在这里，研究人员将大规模直向同源筛选、进化指导的蛋白质设计和rational RNA工程结合起来，以显著改变IscB作为基因组编辑器的活性和功能。随后设计了IscB融合系统，包括碱基编辑器和表观基因组编辑器，并表明基于IscB的表观基因组编辑器OMEGAoff可以使用单载体AAV递送在体内赋予持久的表观基因组编辑以表型结果。
参考信息：
https://www.nature.com/articles/s41587-025-02655-3