2024年5月29日，厦门大学刘亮团队在Nature Biotechnology 在线发表题为“Trans-nuclease activity of Cas9 activated by DNA or RNA target binding”的研究论文，该研究表明由CRISPR RNA和反式激活CRISPR RNA双RNA引导的II型CRISPR-Cas系统对ssDNA和ssRNA底物都显示出RuvC结构域依赖的反式切割活性。

Cas9对反式切割底物具有序列偏好，倾向于切割富含T或C的ssDNA底物。研究发现Cas9的反式切割活性可以被靶ssDNA、双链DNA和ssRNA激活。Cas9与向导RNA和靶RNA复合物的晶体结构为结合靶RNA激活Cas9提供了结构基础。基于Cas9的反式裂解活性和核酸扩增技术，开发了DNA激活Cas9检测和RNA激活Cas9检测的核酸检测平台，能够对DNA和RNA样品进行高灵敏度和特异性的检测。

2类CRISPR-Cas系统，包括II型、V型和VI1型，由于其简单的效应蛋白组成和高效的核酸靶向和切割活性，已成为基因组编辑和核酸检测的实用工具。Cas12a和Cas13a分别是V-A型和VI-A型系统的效应核酸酶，它们都具有两种不同的底物切割模式，一种是顺式靶底物切割，另一种是反式非靶底物切割。Cas12a不仅具有靶双链DNA (dsDNA)切割活性，而且在靶DNA结合后也表现出非靶单链DNA (ssDNA)降解活性。通过将Cas12a的反式DNA裂解活性与等温扩增相结合，建立了一种称为DNA内切酶靶向CRISPR反式报告基因(DETECTR)的方法，用于快速和特异性的DNA样品检测。

Cas13a是一种CRISPR RNA (crRNA)引导的RNA靶向和切割酶，除了具有特异性的顺式单链RNA切割活性外，还具有序列无关的反式单链RNA (ssRNA)切割活性。基于Cas13a的反式RNA裂解活性和等温预扩增，开发了一种用于快速灵敏检测单个RNA分子的特异性高灵敏度酶促报告解锁(SHERLOCK)平台。当与逆转录、链位移或转录步骤耦合时，DETECTR和SHERLOCK可以高灵敏度地检测DNA和RNA样品。最近，基于Cas13a、Cas12a和Csm6的多效应检测平台SHERLOCKv2被开发出来，用于多核酸检测。不同的Cas效应剂具有不同的基底切割偏好，这可以很好地扩展检测平台的样品内复用能力。

crRNA和tracrRNA引导Cas9的反式切割活性（图源自Nature Biotechnology ）

反式切割活性由V型和VI型CRISPR效应蛋白共享;然而，在II型CRISPR效应蛋白中尚未观察到这种情况。ssDNA靶点的结合可以诱导毛螺杆菌科细菌ND2006 Cas12a (LbCas12a) -crRNA复合物对M13噬菌体基因组的快速降解，而化脓性链球菌Cas9-单导RNA (SpyCas9-sgRNA)复合物则没有这种快速降解。目前尚不清楚Cas9效应蛋白是否缺乏反式切割活性或在识别和切割特定底物方面表现出特异性，因为许多Cas酶表现出对反式切割的特异性偏好。此外，crRNA和反式激活crRNA (tracrRNA)是否对反式切割有影响尚不确定。鉴于反式切割活性使Cas酶能够特异性检测DNA或RNA，进一步表征Cas9的反式切割活性和开发基于Cas9的检测技术对该领域具有重要意义。

该研究通过检测一系列序列和结构特异性核酸底物来确定Cas9的crRNA和tracrRNA定向反式切割活性，从而使Cas9成为一种有效的分子检测工具。研究发现靶DNA和靶RNA结合都能触发Cas9不加区分的ssDNA和ssRNA切割活性。该研究分别开发了RNA激活的Cas9检测平台和RNA激活的Cas9检测平台。这两个平台都提供高灵敏度和单碱基特异性的分子检测。

原文链接：

https://www.nature.com/articles/s41587-024-02255-7