2024年1月2日，芝加哥大学何川及戴庆共同通讯在Nature Biotechnology在线发表题为“Ultrafast bisulfite sequencing detection of  5-methylcytosine in DNA and RNA”的研究论文，该研究提出了超快BS-seq (UBS-seq)，它使用高浓度亚硫酸氢盐试剂和高反应温度将亚硫酸氢盐反应加速约13倍，从而减少DNA损伤和降低背景噪声。

UBS-seq允许从少量纯化的基因组DNA构建文库，例如来自无细胞DNA或直接来自1至100个小鼠胚胎干细胞，与传统的BS-seq相比，对5mC水平的高估较少，基因组覆盖率更高。此外，UBS-seq从低输入的mRNA定量绘制RNA 5-甲基胞嘧啶(m5C)，并允许在高度结构化的RNA序列中检测m5C化学计量学。UBS-seq结果确定了NSUN2是主要的“书写”蛋白，负责HeLa mRNA中约90%的m5C位点的沉积，并揭示了哺乳动物mRNA 5 ' -区域中富集的m5C位点，这可能在mRNA翻译调节中具有功能作用。

DNA中的5-甲基胞嘧啶(5-Methylcytosine, 5mC)是一种基本的表观遗传标记，在调控基因表达、染色质组织和细胞身份中起着至关重要的作用。它存在于多种生物体和多种细胞类型中，使其成为生物学许多领域(包括遗传学、表观遗传学和发育生物学)研究的一个有价值的目标。BS-seq是5mC定位的金标准，因为BS试剂具有成本效益和无害性，亚硫酸氢盐处理后的PCR扩增和测序确保了高灵敏度，无需复杂的程序。

BS-seq依赖于每一个未甲基化的胞嘧啶转化为尿嘧啶，但只有单链DNA中的胞嘧啶容易受到亚硫酸氢盐的化学攻击，因此双链DNA (dsDNA)的变性是至关重要的，以避免高背景或不完全转化导致的假阳性。另一方面，亚硫酸氢盐的完全转化需要较长的反应时间和较高的温度等苛刻的条件，这会造成严重的DNA损伤，并由于C位点的偏裂而导致5mC水平的高估。目前，至少有12种商用BS试剂盒可用于DNA中的5mC定位，其中Zymo的EZ DNA甲基化-金试剂盒(称为传统BS条件)是文献中最常用的一种。

目前用于DNA中5mC检测的BS-seq方法存在以下几个局限性：(1)在高温下反应时间长，传统的BS条件需要在98°C下反应10分钟，在64°C下反应150分钟，这对于快速检测或诊断应用并不理想；(2) DNA损伤严重，常规BS处理反应时间长，导致大部分处理DNA在转化过程中降解;(3) C-U转换不完全；特别是在高GC DNA区域或高度结构化的DNA，如线粒体DNA (mtDNA);(4)长时间亚硫酸氢盐处理会通过去嘧啶化优先损害DNA未甲基化的胞嘧啶位点，导致甲基化水平的高估;(5)有限的4mC-to-U转化率可能对含有4-甲基胞嘧啶(4mC)的基因组产生假阳性。尽管最近发展了无亚硫酸氢盐的5mC测序方法，如酶促甲基测序(EM-seq)和TET辅助吡啶硼烷测序(TAPS)来解决DNA降解问题，但它们都包括额外的酶处理步骤，这可能导致转化效率降低，操作复杂性和批次之间的可变性增加。

该研究报道了一种用于DNA和RNA的超快速BS-seq (UBS-seq)方法。采用亚硫酸氢铵和亚硫酸氢铵组成的优化配方，在98°C下进行~10 min的反应，UBS-seq提供了比传统BS条件低得多的背景，特别是在高GC含量或高度结构化的基因组区域，如mtDNA。由于反应时间大大缩短，UBS-seq比传统BS条件造成的DNA损伤更小，并且介导4mC到U的定量转化，以防止4mC位点的假阳性。

与以前的方法相比，当应用于RNA m5C制图时，UBS-seq显著减少了背景，以最大限度地减少假阳性。作者在HeLa mRNA中发现了数千个m5C位点，其中约90%对NSUN2缺失敏感，一小部分是NSUN6底物。通过检测mRNA中m5C位点的分布，发现HeLa和HEK293T mRNA在5'-UTR区域都表现出相同的m5C位点富集特征，这表明这些m5C位点可能调节mRNA的翻译。

原文链接：

https://www.nature.com/articles/s41587-023-02034-w