乙型病毒性肝炎是我国传播范围最广、危害性最大的一种感染性疾病，以肝脏炎性病变为主要表现，容易在此基础上继发肝硬化、慢性肝炎和原发性肝细胞癌等严重疾病，危及患者生命安全[1]。

当前实验室对乙型肝炎相关的检测方法主要分为两种，一种为定性检测——乙型肝炎病毒血清学标志物检测；另一种为定量检测——实时荧光定量PCR检测。

HBV血清标志物的检测可以反映人体对HBV的免疫反应状态；HBV-DNA的定量检测可以了解HBV在体内的复制情况、传染性，并能对治疗效果、耐药性及是否复发进行动态监测。临床通常会把两种方法相结合，评估患者不同阶段的病情。

案例经过

工作中，HBV-DNA与乙肝两对半的检测中，“大三阳”患者的HBV-DNA通常会较高，其中绝大部分患者HBV-DNA的滴度会高于106。未经治疗“大三阳”患者的HBV-DNA往往也是高载量的。然而最近却遇到一位“大三阳”而HBV-DNA阴性的患者。

在回顾和调查了实验前及实验中操作和仪器的因素后，首先排除了实验前造成HBV-DNA假阴性的可能；和免疫室沟通后也排除了HBeAg假阳性的可能。分析后我们把重点放在了HBV-DNA假阴性的探索上。

先确定患者是否正在使用抗病毒药物，由于核苷酸类抗病毒药物和机体免疫力的共同作用，血液中HBV-DNA的转阴要优先于HBeAg的转阴，有可能会出现“大三阳”HBV-DNA阴性的情况.但是和患者沟通后，这种可能也被否定。

暂时我能想到的可能都被否决了，那下一步该怎么办？马老师给出的答复是——换试剂。换了其他两个厂家的试剂继续检测。让我意想不到的情况出现了，两家试剂的检测结果均为阳性且滴度均高达105。

看我一头雾水的样子，马老师给出了答案：其原因可能与厂家引物设计保守序列不同有关，也可能是HBV在体内发生变异，导致部分试剂的引物设计保守序列与HBV的变异造成不相匹配，从而影响DNA的扩增，造成假阴性。但是临床这种情况不多见，出现这种情况的时候，我们可以采用多种试剂进行复核的方法来弥补。

心得体会

PCR假阴性问题因影响因素多、涉及面广、成因复杂，越来越受到临床的重视。下面我将通过实践经验和部分文献，将PCR检测中比较容易忽略的问题小结如下：

• 实验前

1、静脉血采集后2h内分离血清或血浆，如不能及时检测，于-20℃保存，长时间于室温中放置会导致DNA的降解；

2、样本采集应使用对Taq酶没有抑制作用的EDTA或枸橼酸钠做抗凝剂，并防止其他抗凝剂的污染；

3、分离血清或血浆要充分彻底，残留的红细胞释放的血红蛋白对Taq酶有抑制作用；

4、实验室不规范的设置、环境温度和湿度的不适宜、软硬件的不合规、检测人员的操作不规范、检测试剂的活性不达标等等。

• 实验中

1、PCR引物不够保守，病毒出现点突变影响扩增；

2、标本中混入PCR反应抑制物，不能有效扩增；

3、荧光探针结合区序列突变，探针不能与扩增的靶基因结合，无法扩增；

4、病毒DNA与宿主的染色体整合，导致血液中游离的DNA缺乏。

• 实验后

工作区进行消毒清洁时，使用消毒剂的浓度及消毒的次数必须符合规范，要兼顾消毒和防止污染两方面影响。

工作小结

在日常工作中，我们会发现一些检验结果与临床实际不符的情况，有些可以通过分析标本质量、检验过程、仪器的状态找出原因；有些可以通过与患者或者临床护士、大夫的沟通找到原因；但大部分还是需要检验人员运用自己掌握的知识和经验才可以解决。

“打铁还需自身硬”，我们只有不断地学习、积累，才能更好的完成从“检验匠”到“检验师”的转变。

参考文献：

[1] 郭楠,李宝萍,李慧萍，等.反应体系对荧光定量PCR检测乙肝核酸结果影响的分析[J]. 中国实验诊断学,2013,17(5):877-879

来源：检验视界网