01
前 言
冷凝集素主要为IgM类冷自身抗体，高效价的冷自身抗体常可导致离体的抗凝血出现沙粒样的自凝甚至溶血。在合并同种抗体时，也可能会掩盖同种抗体的鉴定，从而干扰患者抗体鉴定及输血相容性的检测，增加其输血难度。
02
案例经过
患者，女性，92岁，因重度贫血（可能与反复胰腺炎后脾功能亢进相关性大）HGB 45g/L入院治疗，申请血型检测、不规则抗体筛查及交叉配血。微柱凝胶法格局：正定型为A型（凝集强度4+）、反定型为O型（凝集强度均为4+），RH（D）阳性，对照孔为阴性（只加入患者红细胞悬液）。
因无其他厂家血型卡，故将标本再次离心后更换血型卡批号重测，反应格局并无改变，正定型A型，反定型A、B、O细胞均为强阳性（对照孔加入患者血浆+试剂盒O型红细胞）。并采用试管法检测，其反应格局为：A管（患者红悬+抗A标准血清）阳性（凝集强度为4+），B管（患者红悬+抗B标准血清）阳性（凝集强度为2~3+），呈AB型。正反定型不符，是A型还是AB型？存在冷凝集素干扰？
查看患者血常规报告，平均红细胞血红蛋白含量（MCH）、平均红细胞浓度（MCHC）均降低，其直方图也并未异常，并不符合冷凝集表现。查看备注提示该标本疑似存在冷凝集素干扰，本结果为37℃温育1h后检测所得，请注意结合临床。
于是增加试验，在4℃、室温、37℃三种温度下进行微柱凝胶法的正反定型（对照孔均加入患者血浆+患者红细胞悬液），并增加抗原抗体反应时间至30min。我们可以看出自身对照孔在室温和4℃放置30min后离心结果均为阳性，凝集强度分别为1+和3+；37℃时结果为阴性，且在4℃下反应后凝集强度明显强于室温，提示存在冷凝集素干扰。
并进行冷凝集素抗体效价测定，准备10支试管分别加入200ul生理盐水，加入200ul患者血浆连续倍比稀释后，再加200ul浓度为4%的O型红细胞悬液（存在一个错误下文中会分析），4℃放置1h后离心观察凝集现象。结果显示该患者效价为64，肉眼可见在1:32时有凝集，在镜下可见1:64时有微小凝集。那么问题来了，冷凝集素干扰该如何进行血型鉴定、不规则抗体筛查试验和交叉配血呢？
吸取患者EDTA抗凝管中离心后的压积红细胞，用37℃生理盐水三洗红细胞后，进行冷吸收试验。再吸取500ul患者血浆与500ul洗涤后的红细胞1:1混合，放入4℃冰箱吸收处理1h。用吸收后的血浆进行不规则抗体筛查试验检测，发现Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ号反应孔凝集强度仍为4+，并无明显改变。
考虑可能为冷凝集素效价过高等因素，导致吸收不彻底而需要重复吸收。但患者本身重度贫血红细胞量少，于是采用近期O型献血者留存血辫混合，经37℃温育后的生理盐水三洗红细胞后，放入4℃冰箱吸收处理1h，重复吸收三次后，检测不规则抗体筛查试验，凝集强度均呈1+，有所减弱。那问题来了，到底是冷凝集素未被吸收彻底，还是同时存在其他自身或同种抗体呢？
带着疑问，将患者标本送检长春博迅实验室。结果既在预料之中，血型为A型，含有冷凝集素和特异性不规则抗体；又在预料之外，抗体特异性无法确定？
其抗体鉴定实验室采用了两种方法，第一种全程37℃进行抗体鉴定；第二种稀释血浆做抗体鉴定 ，将血浆稀释 50、100倍，分别进行4℃、37℃抗体鉴定，孵育分别置于37℃和4℃ 15min，离心5min，判读结果。结果两种方法均与谱细胞格局（采用长春博迅谱细胞和REAGENS谱细胞）无相符，而无法确定抗体。
03
案例分析
在本案例中使用的长春博迅血型卡，反定型对照孔不含增强剂，与Ac、Bc孔中中性凝胶等成分相同。故我们采用了对照孔的三种做法进行质控：
①只加入患者红细胞悬液，作为标准红细胞的阴性对照。结果为阴性，提示患者红细胞未被IgM抗体所致敏；
②加入患者血浆和试剂盒中的O型红细胞，作为患者血浆的阴性对照。结果为阳性（4+），提示患者血浆中可能存在ABO外抗体，干扰反定型；
③加入患者血浆和患者红细胞悬液，作为盐水自身对照。结果为阳性（1+），提示可能存在自身抗体。
综合分析，提示自身对照凝集（1+）弱于加入患者血浆和试剂盒中的O型红细胞的凝集强度（4+），提示可能存在不典型的自身抗体。
本案例试验中存在几处不严谨：
①在测定冷凝集效价的试验中，患者倍比稀释血浆和4%的O型红细胞悬液的比例错误地使用了1:1，而未正确使用2:1的比例，可能将冷凝集素进一步稀释，实际效价明显高于64；
②在使用37℃生理盐水洗涤患者自身红细胞后，进行吸收自身血浆前，未将洗涤后的红细胞与正常献血者AB浆反应观察有无凝集，以判断是否洗涤彻底，仍存在凝集时，可45℃微热放散或者用巯基试剂（0.01M的DTT或0.1M 2-ME应用液）处理红细胞；
③用异体O型红细胞进行吸收患者血浆前，未用ZZAP（1%半胱氨酸活化的木瓜蛋白酶、0.2MDTT和pH7.3的PBS混合物）处理红细胞移除免疫球蛋白和补体，并增强吸附（本实验室无此试剂）；
④吸收完毕后，并未使用洗涤后的红细胞（未使用）测试吸附血浆样本，以确保吸附完全。
冷凝集素一般为抗-I、抗-IH、抗-HI、抗-Pr等，成人红细胞基本都为I阳性，本例冷凝集素与其他细胞反应强，与自身细胞反应弱，可能不是抗-I，或者患者红细胞I抗原异常；患者红细胞血型正定型4+，排除亚型可能，H抗原应该完好，因此样本冷凝集素应与抗-H无关。长春博迅实验室采用多种方法抗体鉴定，结果不同细胞间凝集强度均有差异，存在阴阳性的区别，说明样本中除冷凝集素外还含有特异性的同种抗体，但未能清晰鉴定出抗体的特异性。
04
案例总结
本案例虽然并非一个成功的案例，但也体现了基层输血人在有限的实验室条件下，对疑难输血作出的努力尝试。对于采用的两种抗体鉴定方法，均存在一定的缺陷。在采用全程37℃进行抗体鉴定时，未用吸收方法解决冷自身抗体对鉴定的干扰；采用稀释血浆进行抗体鉴定，可能致同种抗体被稀释，部分抗体可能存在剂量效应等因素导致与谱细胞反应格局不明显，抗体无法确定，甚至可能漏检低效价的同种抗体。
05
专家点评
成都市新都区中医医院检验科主任 廖建
本案例充分体现了本科室人员，以病人为中心，对疑难配血的积极探索。冷凝集素干扰血型鉴定和输血相容性检测，虽较为常见，但在合并其他抗体如同种抗体时，抗体鉴定就显得更加困难。对于存在冷凝集素患者，还应注意冷凝集素在31℃以下时即可活化，而血库红细胞悬液保存在2℃-6℃冰箱中。当患者输血时，会因血液制品与人体温度的明显差异，而激活患者体内冷凝集素，导致患者自身红细胞凝集，进而可能导致红细胞破坏或寿命缩短。所以此类患者输血时应使用输液加温器加温输注，在无输液加温器时更应注意患者保暖，特别是输注部位的保暖，并加强巡视监护。本案例通过相关试验及文献复习，为我科疑难输血积累了一定经验。
参考文献：
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来源：检验医学https://mp.weixin.qq.com/s/uimnfrh_NOm2ap0EcPyMcA