ctDNA在HCC诊断和预后中的作用
1. ctDNA作为 HCC标志物的理论基础
在HCC的背景下，cfDNA/ctDNA已经作为早期诊断、治疗结果和患者预后的非侵入性标志物被研究，其重点是关注血浆中cfDNA水平或肿瘤来源ctDNA的突变谱和甲基化特征。对HCC的突变情况，最频繁检测到的突变是TERT、TP53和CTNNB1。其中，TERT启动子突变是最常见的基因突变。由于HCC的病因不同，ctDNA的突变情况也不尽相同，因此可以根据病因进行个性化的ctDNA突变检测。在甲基化变异方面也有研究表明，从血浆中检测的DNA甲基化标志物在HCC病例与健康对照组和肝硬化对照组中存在明显的区别，并且已有DNA甲基化标志物能准确检测HCC，证实了其用于HCC早期检测的临床可行性。最近一项Meta分析还评价了ctDNA在HCC诊断中的准确性，结果证明ctDNA的诊断性能优于经典HCC标志物AFP。与此同时，Mody等先导性的研究也证明了对 HCC 患者进行 ctDNA 评估的可行性。故而，ctDNA作为HCC生物标志物存在着理论上的可行性。
2.循环游离DNA（cfDNA）的定量检测
Bubu A. Banin等就认为：在HCC患者中，总cfDNA浓度显著高于非HCC患者，尽管cfDNA升高与HCC无特异性，但它在HCC筛查、治疗反应监测和预测HCC复发方面具有潜在的实用价值。而一项针对24例HCC患者和62例乙型肝炎（HBV）患者进行的研究表明了HCC患者的血浆cfDNA水平显著高于对照患者。不仅如此，cfDNA的定量检测在与HCC其他诊断标志物综合分析时，大大提高了对HCC的诊断性能。一项对22项研究（包括2 424名受试者中1 280名HCC患者）的Meta分析表明，cfDNA定量与 AFP 结合可能在 HCC 诊断中发挥潜在作用，敏感性为82%、特异性为96%。关于cfDNA与HCC的预后监测，最近一项对48例HBV相关HCC患者的研究认为血浆总cfDNA水平可作为预测HBV相关HCC患者早期复发的生物标志物 ，其 中 HBV-DNA、Child-Turcotte-Pugh（CTP）分 级 、TNM分期、肿瘤数目、血管侵犯与血浆cfDNA呈正相关，白蛋白、凝血酶原时间（PT）、肿瘤直径与血浆cfDNA呈线性相关。由此看来，cfDNA 定量作为一种生物标志物用于HCC诊断和预测具有一定的生物学价值。
血浆中 cfDNA 的浓度在一定程度上反映了肿瘤的负担，但对HCC的早期诊断和预后监测存在一些不足。一方面，在健康对照人群中cfDNA的浓度也存在一定差异，这表明其水平可能因检测平台的不同而不同。因此，cfDNA“水平”的报告应注意使用同一平台进行系列评估，以限制分析之间的可变性。另一方面，持续活动性肝炎患者具有较高肝脏来源的cfDNA，从而会影响cfDNA的浓度，这在分析结果时是一个重要的干扰因素。虽然肝脏炎症的严重程度会影响cfDNA的浓度，但目前尚不清楚肝功能异常的严重程度是否会影响 cfDNA 的浓度。总的来说，定量 cfDNA 作为HCC早期检测和预后监测的生物标志物似乎是有限的。
3. ctDNA的突变检测
最近一项旨在评估ctDNA 在 HCC 中的诊断和预后价值的研究，分析了 26例HCC患者的血液样本及肿瘤组织，从25个HCC基线血浆样本中鉴定出TP53 （50.00%）是最常见的突变基因，R249S是最易复发的突变（19.2%），其中23例患者（88.5%）携带至少一个在相匹配组织中有效的ctDNA突变；该研究也表明HCC患者ctDNA突变数、最大变异等位基因频率和ctDNA浓度与肿瘤大小呈线性相关。虽然这充分显示了TP53、R249S突变的诊断潜力，但Rice等总结了多项研究后认为这两种突变存在一定的地域差异，且只对某些区域的HCC具有高度特异性。不仅如此，最近的一项研究通过ddPCR技术对218例早期和晚期HCC患者血浆进行了分析，结果显示 48% 的患者携带了 TERT 启动子突变（TERT C228T和C250T启动子突变）。然而，该研究在81例没有HCC影像学证据的肝硬化患者中，也发现了9%的患者有TERT突变。虽然这在一定程度上反映了该标志物在HCC发生发展中的重要性，但更反映出其对HCC早期发现没有特异性。由此看来，ctDNA突变的检测对HCC的诊断表现出很大的潜力，但是单一特异性的ctDNA突变并不能作为高特异性的HCC的诊断生物标志物。
目前NGS技术改进对HCC中频繁的遗传学改变有了更好的了解，能够全面分析ctDNA的突变，并扩大候选突变生物标志物的范围。虽然单一特异性的ctDNA突变存在缺陷，但并不能否认ctDNA突变作为生物标志物对HCC诊断的价值。最近一项对 37例 HCC患者和 6例健康对照的研究，血浆 ctDNA 突变检测与 AFP 联合检测对 AFP 阴性HCC的敏感度为73%，特异度为100%；对AFP阳性的HCC的敏感度为53%，特异度为100%。这些结果表明，联合检测AFP和血浆ctDNA中的突变对HCC的诊断效果优于单独检测AFP。所以，ctDNA突变作为HCC诊断生物标志物不仅是具有辅助作用，对HCC的诊断更具临床价值。
4. ctDNA甲基化异常检测
DNA甲基化是一种DNA化学修饰的形式，也是基因表达表观遗传调控的核心机制，在不改变DNA序列的前提下控制基因的表达。最近研究表明，在晚期HCC患者中DNA甲基化改变驱动上皮细胞转变为间充质状态介导了对索拉非尼的耐药性并预测对治疗的耐药性。这表明了ctDNA甲基化与HCC发生和发展的密切联系，展现出DNA甲基化标志物在HCC患者血浆中的高诊断和预后潜力。DNA甲基化通常是在健康情况下调节基因的表达，且被认为有器官特异性，同时可以作为癌症异常甲基化的模板进行分析。通过细胞特异性的DNA甲基化特征即ctDNA甲基化，可以识别cfDNA的组织来源，为早期检测癌症提供了一个有吸引力的靶点。最近的一项针对33项研究（包含4 113个受试者）的Meta分析表明，ctDNA中 RASSF1A 甲基化可作为 HCC 筛查的潜在生物标志物。一项研究调查了 98例 HCC患者和 191例对照组中SEPT9的cfDNA甲基化的诊断作用：SEPT9甲基化检测显示HCC诊断的准确性很高，但是不足的是对巴塞罗那临床肝癌分期 A期（HCC早期）疾病的敏感度仅为 64％。因此，仍然有其他ctDNA的单一甲基化候选指标在早期发现HCC方面值得更深入研究。
在单一甲基化指标表现出巨大潜力的同时，通过甲基化组合来进一步提高诊断性能更让人们感兴趣。通过比较TCGA HCC 组织和正常血液白细胞，一项研究确定了HCC特异性甲基化标记位点，并且根据715例HCC患者和560例健康对照的实验数据中采集出的cfDNA样本，选择了10 个 甲 基 化 标 记 位 点（BMPR1A；PSD；ARHGAP25；KLF3；PLAC8；ATXN1；Chr6：170；Chr6：3；ATAD2；Chr8：20）。在 383 例 HCC 患者和 275 例健康对照的cfDNA样本中检测这10个甲基化标记位点进行验证。在实验数据中对 HCC 检测的敏感度为 85.7％ ，特异度为94.3％ ；在验证数据中的敏感度为 83.3％ ，特异度为90.5％。10个甲基化标记位点不仅显示出较高的诊断特异性和敏感性，而且与肿瘤负荷、治疗反应和分期高度相关。这个大型临床队列研究，证明了 ctDNA 甲基化标志物在HCC的诊断，监测和预后中的实用性。还有一项研究分析了95例HCC患者、51例肝硬化患者和98例健康对照者的DNA 甲基化 ，发现 6 个甲基化位点（HOXA1；EMX1；AK055957；ECE1；PFKP和CLEC11A），其最佳拟合模式对HCC检测的敏感度为95%，特异度为92%，并认为其优于甲胎蛋白的检测性能。总的来说，异常DNA甲基化作为生物标志物对HCC诊断和预后的价值和巨大潜力。
5. ctDNA在HCC预后中的作用
ctDNA作为生物标志物在HCC诊断中表现出高特异性和高敏感性的同时，其同样适用于HCC预后监测。最近一项针对晚期HCC患者的探索性研究表明，cfDNA的定量变化主要与肿瘤的负担和治疗效果有关，而ctDNA的质量变化可以检测整个肿瘤的遗传变异，这既支持了cfDNA/ctDNA在晚期HCC患者中的预后价值，又证明了具有预测治疗反应的潜力。就ctDNA 的质量变化而言，在肿瘤特异性热点突变和异常DNA甲基化方面的研究结果也十分可观。一项对36例手术切除HCC患者的研究表明，在69%接受手术切除的HCC患者中检测到 124 bp G>A hTERT 启动子突变，此突变是HCC疾病进展的独立预测因子，并且验证了其作为预测患者生存期生物标志物的预后价值。不仅如此，单个或一组基因的ctDNA甲基化也被证明是一个重要的预后因素。一项对155例HCC手术切除患者的研究表明，cfDNA胰岛素样生长因子结合蛋白7的启动子甲基化与较低的总生存率和早期肿瘤复发独立相。最近针对1 098例HCC患者进行的一项大规模研究确定了预后特异性的甲基化标记位点，并且选择的8个甲基化标记位点（SH3PXD2A；C11orf9；PPFIA1；Chr 17：78；SERPINB5；NOTCH3；GRHL2；TMEM8B）与实验和验证队列中的总生存率独立相关 。总之，ctDNA作为生物标志物在HCC的预后中在表现出巨大价值的同时，需进一步优化和探索。
引用本文：范子豪, 任锋. 循环肿瘤DNA在肝细胞癌诊断和预后中作用的最新进展[J]. 中华肝脏病杂志, 2022, 30(12): 1382-1386. DOI: 10.3760/cma.j.cn501113-20200419-00197.
文章来源：中华肝脏病杂志