胃癌是全球第5大常见癌症，也是第4大癌症死因 [1]，中国胃癌病例数量约占东亚地区总数量的一半 [2]。当前胃癌诊疗过程中仍缺乏高特异性、高灵敏度的生物标志物。
基因甲基化被认为与肿瘤的发生、发展和细胞癌变存在密切的联系，几乎所有肿瘤都已发现特异性的基因甲基化标志物 [3]。先前研究表明，在胃癌患者癌组织中甲基化Septin9基因（methylated Septin9 gene，mSEPT9）特征性增高 [4]。由肿瘤细胞坏死、凋亡所释放到外周血的循环肿瘤DNA（ctDNA）携带与原发肿瘤组织一致的分子改变 [5]。ctDNA甲基化分析被认为是肿瘤领域极具潜力的技术手段 [6]。
本研究通过检测胃癌患者血浆mSEPT9，分析其甲基化状态和相对定量结果，探讨其在胃癌诊断、术后病理学分期严重程度评估、治疗反应预测中的价值和临床意义。
回顾性分析2020年4月—11月在复旦大学附属中山医院检验科检测血浆mSEPT9的所有病例。经筛选纳入221例诊断为胃癌的患者以及34例无疾病证据受检者作为对照。同时收集所有入组者的相关临床资料，包括临床病理学资料（患者基本信息和病理学检查结果）和血清蛋白标志物[癌胚抗原（CEA）、糖类抗原（CA）12-5、CA19-9和CA72-4]。本研究经复旦大学附属中山医院医学伦理学委员会批准，患者均知情同意。
所有胃癌患者的诊断均经病理学检查确诊，符合相应的诊断标准且均为原发性肿瘤。未经治疗组即胃癌患者未行放化疗、手术治疗或全身治疗。
肿瘤治疗反应根据实体瘤疗效评价标准（RECIST）1.1版分为完全缓解（CR）、部分缓解（PR）、稳定（SD）和疾病进展（PD）。
Septin9基因甲基化检测试剂盒（PCR荧光探针法）购自博尔诚（北京）科技有限公司，ABI 7500实时荧光定量PCR仪购自美国ThermoFisher Scientific公司，Roche Cobas e801全自动电化学发光分析仪及配套的CEA、CA12-5、CA19-9和CA72-4检测试剂盒购自瑞士Roche公司。
所有检测均在复旦大学附属中山医院检验科完成。按照Septin9基因甲基化检测试剂盒（PCR荧光探针法）说明书对受检者血浆中DNA进行提取、亚硫酸盐转化处理、多重PCR扩增并进行结果判断。质控合格条件下，ACTB Ct≤32.1，mSEPT9 Ct≤41.0时判定为阳性。
应用ΔΔCt法对mSEPT9甲基化水平进行相对定量，公式如下 [7-8]：
ΔΔCt检测样本 = ΔCt检测样本-ΔCt校准样本
ΔCt检测样本 = Ct检测样本(ACTB)-Ct检测样本(mSEPT9)
ΔCt校准样本 = Ct校准样本(ACTB)-Ct校准样本(mSEPT9)
此处校准样本即每批次阳性质控品。
采用电化学发光法，受检者血清标本按照Roche Cobas e801全自动电化学发光仪及配套试剂盒说明书操作。CEA参考范围为0 ~ 5 ng/ mL；CA12-5参考范围为0 ~ 25 IU/mL；CA19-9参考范围为0 ~ 34 U/mL；CA72-4参考范围为0 ~ 10 U/ mL。
采用SPSS Statistics 26.0和Prism v9.0.0进行统计学分析，两组数据间的比较采用配对t检验，分类数据的组间比较采用χ2检验，不同诊断方法的比较采用受试者工作特征（receiver operating characteristic，ROC）曲线分析判断其诊断效能，选取最佳截断值，得到相应的敏感度和特异度。采用双侧检验，P<0.05为差异有统计学意义。
本研究共纳入221例胃癌患者，mSEPT9阳性率为27.60%（61/221）。其中有80例患者未经治疗，mSEPT9阳性率为35%（28/80）。
胃癌患者基本临床信息见表1，其中男性138例（62%），女性83例（38%），患者年龄30 ~ 84岁，中位年龄62岁。
34例无疾病证据受检者，mSEPT9阳性率为0%（0/33），其中男性18例，女性16例，年龄34 ~ 83岁，中位年龄63岁。
以80例未经治疗胃癌患者为疾病组，34例无疾病证据受检者作为对照组，采用单一标志物检测胃癌并绘制ROC曲线进行分析。mSEPT9阳性率为35%（28/80），曲线下面积（area under curve，AUC）为0.815 3，灵敏度为35%，特异度为100%。其阳性率、AUC、灵敏度和特异性均为5项指标中最优（表2、图1）。5项指标联合检测诊断胃癌的效能略有改善，在敏感性上有明显提升。
脉管内见癌栓、侵及浆膜层或周围组织和存在淋巴结转移的胃癌患者术前mSEPT9阳性率较高，差异有统计学意义（P均<0.05，表3）。是否存在神经侵犯与胃癌患者术前mSEPT9阳性率无显著相关性。
与治疗后出现PD的患者相比，治疗后出现PR和SD的患者mSEPT9阳性率明显更低（P = 0.000 2，表4）。未经治疗患者组和经治疗患者组间mSEPT9阳性率差异无统计学意义。
在14例连续监测患者中，患者PD前和PD时mSEPT9 ΔΔCt差异有统计学意义（P = 0.028 4，图2）。未经治疗患者组和经治疗患者组间mSEPT9 ΔΔCt差异无统计学意义。6例治疗前后接受mSEPT9检测的患者也未见SEPT9 ΔΔCt有统计学意义。
mSEPT9基因与肿瘤的发生、发展密切相关 [9]，大量临床研究已经验证了mSEPT9在结直肠癌筛查和早期诊断中的性能。目前，该检测已经获得美国食品药品管理局、中国国家食品药品监督管理总局和欧盟CE认证审批，但mSEPT9检测在其他消化道癌症全病程管理中的价值尚未得到充分论证，胃癌中的相关数据也鲜有报道。
本回顾性研究表明，mSEPT9在胃癌未治疗人群中的诊断灵敏度为35%，特异度为100%，其诊断效能比起传统血清蛋白标志物具有一定优势，这与王炳龙等 [10]（灵敏度为43.71%，特异度为95.12%）以及贺娜等 [11]（灵敏度为46.9%，特异度为95.7%）的研究结果一致。本研究结果特异度理想，但灵敏度较低，这可能是受制于标本量和患者纳入标准不同。本研究进一步分析了5项指标联合检测效能，仅在敏感性上有明显改善。因此，临床实际开展5项指标诊断胃癌，仍待卫生经济学评估。本文相较于其他研究所比较的血清蛋白标志物更加全面，但由于胃良性疾病例数太少，未纳入本次分析。本研究结果表明，在机会性筛查中，mSEPT9检测仍可以成为侵入性胃镜的一种耐受性良好的补充检查手段。
此外，本研究还分析了胃癌患者血浆mSEPT9与临床病理学特征的相关性，结果显示有脉管癌栓、侵及浆膜层或周围组织和有淋巴结转移的患者血浆mSEPT9阳性率较高，表明血浆mSEPT9与术后病理学分期存在密切联系（P <0.05）。这符合目前对癌症特异性ctDNA甲基化的认识，即能提供一定的相关信息 [12]。
本研究进一步探究了mSEPT9与患者预后的相关性，发现在PD患者中mSEPT9阳性率较高（P <0.05）。存在大量关于ctDNA甲基化水平评估预后和动态监测的研究结果及临床试验的报道。例如，在结直肠癌中mSEPT9水平变化对疾病状态预测的准确率为69.2% [13]；晚期肺癌患者中PR患者mSHOX2 ΔΔCt变化程度显著大于SD患者 [14]；KLK10甲基化与乳腺癌复发和辅助治疗后无瘤生存期缩短显著相关 [15]等。本研究未能发现mSEPT9在治疗前后的差异具有统计学意义，可能是由于本研究为回顾性研究，故患者采血点并非严格控制，可能使结果出现偏差。
鉴于目前商品化试剂盒仅能提供定性结果，我们引入ΔΔCt法对甲基化程度进行相对定量，结果发现患者PD前mSEPT9 ΔΔCt较PD时更低，平均变化幅度为2.028，差异有统计学意义。本研究提示同一患者血浆mSEPT9的相对定量结果可以在分子水平提示胃癌疾病发展，是预后预测和动态监测的潜在生物标志物。未来甲基化检测的发展方向应着重于定量甲基化水平以辅助纵向监测。
综上，本研究为日后临床进一步使用血浆mSEPT9检测诊断胃癌提供一定科学依据。mSEPT9的相对定量结果与术后病理学分期和治疗反应预测有一定的相关性，但仍需要更多的临床研究予以验证。
来源：基因谷