近日，《Cancer Discovery》发表了一项大型前瞻性、非干预性、观察性I-III期肺癌术后ctDNA-MRD研究结果，结果显示：纵向ctDNA-MRD检测为阴性的患者可以定义为潜在的治愈患者，并且无法从辅助治疗中受益。ctDNA-MRD转阳或复发的高峰期在术后第12-18个月左右，提示临床应至少密切观察18个月。如果ctDNA-MRD持续阴性至第18个月后，其复发风险逐渐降低。1
该研究共纳入261例I-III期（肿瘤直径≥2cm）NSCLC患者，经过根治性手术切除后进行术后动态血液ctDNA-MRD检测，其中术前血液样本261例，术中肿瘤组织256例，术后血液样本652例。在这项研究中，系统地回答了以下四个问题：1）Nonshedding tumor（非脱落肿瘤）问题；2）ctDNA-MRD PPV及NPV问题；3）ctDNA-MRD灵敏度问题；4）ctDNA-MRD指导辅助治疗问题。
▲ 患者纳入亚分析流程图，系统回答了临床上四个问题
技术层面分析
ctDNA-MRD检测策略：（非完全）Tumor-agnostic assays策略，固定panel；
检测panel：使用类似CAPP-seq panel的设计概念，开发了一款固定化338基因MRD panel，大小为0.55Mb，专门用于肺癌、结直肠癌和肝细胞癌（设计原则是三种癌症类型中最常见的驱动基因 + 免疫治疗相关敏感/耐药基因 + Geneplus近5万相关癌症数据库及COSMIC和TCGA数据库中的热点突变区域）；基线肿瘤组织检测为1,021基因大panel，大小为1.5Mb；
检测样本：肿瘤组织样本（新鲜冷冻组织/FFPET），血浆cfDNA样本（20ml全血）；
样本input量：gDNA为400~800ng；cfDNA为52ng（中位值）；
建库方法：探针杂交捕获法（IDT），其中cfDNA建库添加UID接头；
测序平台：DNBSEQ-T7RS测序仪（MGI）或Gene+Seq-2000测序系统（吉因加）
测序深度：肿瘤组织样本平均测序深度为1,214X，检出中位突变数为6个（1-93）；血浆cfDNA样本平均测序深度为30,000X；
cfDNA LoD：变异等位基因频率（VAF）的LoD为 0.1%；
ctDNA-MRD分析：检测到至少一种变异的血浆样本被定义为ctDNA-MRD阳性。其calling有两种方式，一种是Tumor-informed calling，一种是Tumor-naïve calling。其中肿瘤组织衍生的变异，在血浆ctDNA中判断的话，驱动基因需要≥2条reads，乘客基因需要≥4条reads，如果非肿瘤组织衍生的变异，判断标准会高一倍，驱动基因需要≥4条reads，乘客基因仅需要≥8条reads；
▲ ctDNA-MRD检测框架
ctDNA-MRD检测样本采集情况： 研究者在术前和术后预先设定的时间点，分别使用两支10ml的streck管采集外周血20ml。手术前3天采集术前血液样本。未接受辅助治疗的患者以术后1个月（±7天）为landmark（界标）时间点。对于接受辅助化疗的患者，辅助治疗前时间点定义为手术后及辅助治疗前至少1周，landmark时间点为最后一个化疗周期后1个月（±7天）。对于长期接受EGFR抑制剂或ICIs辅助治疗的患者，landmark时间点为手术后及辅助治疗前1个月（±14天）。Longitudinal（纵向）时间点为landmark检测后每3~6个月一次。Surveillance（监测）时间点为临床复发前6个月内的检测。由于前瞻性的影像学随访和采血在同一时期，监测时间点可能与临床复发在同一天。
▲ ctDNA-MRD研究流程
*Landmark：界标时间，即术后/辅助治疗后1个月内的单点检测
Longitudinal：纵向时间，即Landmark检测后每隔3-6月进行一次检测
Surveillance：监测时间，即临床复发前6个月内进行的检测
该研究的主要发现有：
1）Nonshedding tumor（非脱落肿瘤）问题：
考虑到肿瘤的存在，术前ctDNA检测可用于评估每个个体的肿瘤DNA脱落情况。所有入组患者（261例）术前均成功进行ctDNA检测，然而只有36.4%（95例）是阳性的（中位VAF为0.71%），这么低的阳性比例可能与肿瘤自身脱落DNA有关，也可能与检测方法灵敏度不够有关。
为了进一步阐明ctDNA的检测性能和肿瘤的非脱落性问题，研究者进一步对11例 I 期患者，术前2轮外周血ctDNA检测，术中通过肺叶标本切除下来后收集肺叶静脉残端血检测ctDNA，两种ctDNA检测显示100%一致。其中6例患者肺叶静脉残端血和外周血ctDNA检测均为阴性，证实了确实存在肿瘤本身不释放ctDNA的Nonshedding肿瘤的存在。另外，5例肺叶静脉残端血ctDNA阳性，其中3例外周血ctDNA只有1轮阳性，这也提示目前的技术手段对低频突变（特别是VAF<0.05%）的检测灵敏度是不足的。
▲ 11例I期NSCLC患者：2轮外周血ctDNA vs 肺叶残血ctDNA
更为重要的是，术前血液中检测不到ctDNA似乎并不影响其监测疾病复发的有效性。41例复发性ctDNA-MRD阳性患者中，14例（34.1%）术前ctDNA检测为阴性。相反，所有ctDNA-MRD未检测到的复发患者术前ctDNA检测均呈阳性（6/6，100%）。
▲ 通过复发患者反推术前ctDNA与术后MRD检测及复发关系
2）ctDNA-MRD PPV及NPV问题：
术后单点（landmark）ctDNA-MRD的PPV达81.0%，NPV达86.6%，纵向分析可进一步提高准确度，纵向（Longitudinal）ctDNA-MRD的PPV可达89.1%，NPV可达96.8%，意味着术后ctDNA-MRD持续阴性，其复发的可能仅为3.2%。纵向ctDNA-MRD检测为阴性的患者可以定义为潜在的治愈患者（与术后单点检测相比，纵向分析曲线近乎完美）。
▲ 术后ctDNA-MRD动态分析
此外，对II-III期肺癌患者术后的ctDNA-MRD动态分析发现，ctDNA-MRD转阳或复发的高峰期在术后第12-18个月左右，提示临床应至少密切观察18个月。如果ctDNA-MRD持续阴性至第18个月后，其复发风险逐渐降低，可定义为潜在治愈人群。
▲ ctDNA-MRD转阳或复发的高峰期在术后第18个月左右
3）ctDNA-MRD灵敏度问题：
术后单点（landmark）的ctDNA-MRD灵敏度为36.2%，纵向（Longitudinal）时间点的ctDNA-MRD灵敏度可提高到87.2%。这也提示：就目前而言，单次术后ctDNA-MRD检测的灵敏度是小于50%的，持续的纵向ctDNA-MRD检测可大幅提高其灵敏度。
▲ ctDNA-MRD检测灵敏度分析
4）ctDNA-MRD指导辅助治疗问题：
术后ctDNA-MRD检测阴性患者的肿瘤负荷极低，辅助治疗可能对这些患者是不必要的。术后辅助治疗前ctDNA-MRD检测阳性的患者，辅助治疗可以改善其DFS，但是对于ctDNA-MRD检测阴性的人群，辅助治疗无获益。识别和避免对潜在治愈人群的过度治疗是一个重要的临床问题。
▲ ctDNA-MRD检测与辅助治疗
另外，该研究也存在一定的局限性。1）随访时间较短（中位随访时间为19.7个月）。在该项研究中，只有47例复发。2）landmark检测后没有严格按照每3-6个月进行ctDNA-MRD随访。然而，该研究证实了ctDNA-MRD的预后价值具有足够的统计学意义。
总体而言，在这项前瞻性研究中，研究团队证实了基于ctDNA的MRD评估对NSCLC根治术后患者的预后价值。同时，研究团队还强调了ctDNA-MRD纵向分析的临床应用价值：ctDNA-MRD阴性可以用于确定局部NSCLC的潜在治愈患者。此外，亚组分析提示，ctDNA-MRD阴性的患者可能不需要辅助治疗。最后，研究团队指出，脑复（转）发（移）仍然是NSCLC ctDNA-MRD监测的一个主要挑战，未来是否会考虑CSF-MRD进行监测？
参考资料：
1.Jia-Tao Zhang, Si-Yang Liu, Wei Gao, Si-Yang Maggie Liu, Hong-Hong Yan, Liyan Ji, Yu Chen, Yuhua Gong, Hong-Lian Lu, Jun-Tao Lin, Kai Yin, Ben-Yuan Jiang, Qiang Nie, Ri-Qiang Liao, Song Dong, Yanfang Guan, Pingping Dai, Xu-Chao Zhang, Jin-Ji Yang, Hai-Yan Tu, Xuefeng Xia, Xin Yi, Qing Zhou, Wen-Zhao Zhong, Xue-Ning Yang, Yi-Long Wu; Longitudinal Undetectable Molecular Residual Disease Defines Potentially Cured Population in Localized Non–Small Cell Lung Cancer. Cancer Discov 2022.