但是，DFI这一指标存在根本性的缺陷：DFI的实质是“细胞数比值”，用“细胞数比值”这一细胞层面的“指标”，来描述“DNA碎片/断裂”这一分子层面的情况，是非常间接的，并且会带来诸多的问题：
1. DFI检测没有标准品，无法进行真正的室间质控。由于DFI是精子数比值，研究人员很难针对“完整的精子”来构建满足国家行业要求的标准品。没有标准品，就无法进行室间质控（不同实验室检测结果不一致时，没有标准品来进行裁定）。因此，缺乏标准品和室间质控的DFI，从方法学原理上是存在巨大缺陷的。
2.吖啶橙无法识别双链断裂造成的DNA双链碎片，导致检测结果的不全面。
3.流式细胞仪价格昂贵，维护成本高，不适合大规模推广。
近期，华中科技大学肖先金教授、吴曈勃副教授、相文佩教授团队合作在国际上首次直接针对精子DNA的断裂点构建了荧光探针检测技术，并提出了“平均精子DNA断裂点个数”（Mean number of sperm DNA breaks, MDB）这一新指标，在“分子层面”实现了对精子DNA碎片化程度的“直接评估”。结果显示：MDB比DFI更准确，与临床结局更相关，并且无需流式细胞仪等大型仪器，操作更简便、成本更低。
该工作近期已发表于检验医学Top 1期刊《Clinical Chemistry》（https://doi.org/10.1093/clinchem/hvab280）
团队进一步与公司合作，开发了试剂盒，并按照国家药监局的标准完成了体外诊断试剂的注册，实现了科技成果的转化，真正地将“论文写在了祖国大地上”。
题目：Evaluation of sperm DNA integrity by mean number of sperm DNA breaks rather than sperm DNA fragmentation index
作者：Bei Yan（颜贝）, Weicong Ye（叶玮聪）, Juan Wang（王娟）, Shaotong Jia（贾韶彤）, Xiuli Gu（辜秀丽）, Hao Hu（胡浩）, Wenpei Xiang（相文佩）, Tongbo Wu（吴曈勃）, Xianjin Xiao（肖先金）
本研究独创性应用精子DNA断裂位点数作为报告指标，可同时检测单双链断裂。由于本实验中，碎片化程度与荧光速率正相关，进而计算可给出精子DNA断裂点的平均值(MDB)，用于评价精子DNA碎片化程度。本方法通过评估断裂程度弥补了DFI仅能评估精子是否存在断裂的缺陷，以信号强度作为精确定量衡量指标取代了DFI划分信号阈值评价的定性指标，实现了对于SDF的精确定量评价，解决了目前暂无精确定量检测精子DNA碎片化程度的评价手段这一领域空白，在评估临床用药疗效等应用上具有更高的评价能力与参考价值。
本研究基于末端转移酶（TdT）、核酸内切酶IV（Endo IV）、DNA荧光探针，开发了检测精子DNA断裂点个数的新方法，创建了精子碎片化程度评价的新指标——DNA断裂点的平均数（MDB）。本研究利用MDB和DFI作为指标，对80例临床病人精液样本进行DNA完整性的评估，结合病人精子的其他临床信息和最终的妊娠结局，初步评估了两种方法对精子质量和妊娠结局的预测价值。
本研究的主要结果
1. 精子DNA断裂点检测方法的检测原理和原理验证
如图1，精子DNA发生碎片化时会产生3’-羟基末端（3’-OH）。TdT可识别并延长3’-OH，在dATP的辅助下聚合得到多聚胸腺嘧啶（poly A）序列，实现一次放大。DNA荧光探针可与poly A序列结合，利用Endo IV水解探针产生荧光信号，实现二次放大，且精子DNA碎片化程度与荧光速率正相关。这样的二次放大设计使方法具有高灵敏度，酶的特异性识别使方法具有高选择性。
图1 精子DNA断裂点检测方法的检测原理和原理验证
2.检测方法的检测限和标准曲线
图2 精子DNA断裂点检测方法的检测限和标曲
该检测体系检测范围为0.1-15 nM；检测限为 0.03 nM。
3.本方法检测DNA断裂的可行性验证
使用超声波和限制性内切酶处理λ DNA，均可产生DNA断裂。如图3 A所示，随着超声时间的增加，荧光上升速率明显增大。理论上，Kpn I酶充分酶解消化后λ DNA可断裂成3段。如图3 B所示，随着酶解时间的延长，荧光上升速率随之增大，酶解120 min时的速率接近未酶解的3倍，与理论相符。这些实验有力验证了本方法可以准确定量反应DNA断裂的数量。
图3 断裂点检测方法检测超声和酶切后的λ DNA断裂点数目
4. MDB指标的临床应用与效果评估
本研究利用DFI和MDB指标分别评价80例精子样本的DNA完整性，结果分析显示（图4 A-C）MDB的AUC值（0.7932）略高于 DFI（0.7631）。针对49 例具有临床妊娠结局的样本，采用该两种指标进行了回顾性预测结局。这49份样本的纳入标准排除了年龄和抗苗勒管激素低等基本女性因素。如图4D-E所示， MDB在临床妊娠组和非妊娠组存在显著差异（P=0.0106）。相比之下，这两组之间的DFI差异并不显著（P=0.0548）。此外，在临床妊娠的 ROC分析中，MDB 的 AUC 值（0.7576）高于 DFI (0.6616)。实际临床样本的结果显示，DNA断裂点的平均数（MDB）与精子活力和临床妊娠结局的相关性强于常用的DNA断裂指数（DFI）参数。
图4 精子断裂点检测指标（MDB）和精子DNA断裂指数（DFI）对精子活力和临床妊娠结局的预测价值
结论
本研究开发了一种直接测量精子DNA平均断裂点的方法。该方法具有耗时短、操作简单、分析灵敏度高、对仪器要求低等优点，有利于临床应用。本研究提出的新报告指标“MDB”可能是评估精子DNA完整性的更直接、准确和临床意义重大的指标。
实验室介绍
华中科技大学同济医学院生殖健康研究所肖先金教授课题组
肖先金教授课题组致力于生殖疾病诊疗新技术的开发与临床转化。实验室具备齐全的各类生物化学和生物光子学实验所需的仪器。现拥有的大型仪器包括：单细胞生化分析仪、实时荧光定量PCR仪、流式细胞仪、多功能酶标仪、微流控芯片系统等，并共享国家地方联合工程实验室的倒置荧光显微镜、分选型流式细胞仪、显微操作系统等大型设备。
基于该平台，课题组进行了大量的科研及临床转化工作。目前已在Nature Communications、Nucleic Acids Research、 ACS Nano、Clinical Chemistry 、Chemical Science， Analytical Chemistry， Chemical Communications等生化分析、分子诊断领域国际权威期刊发表论文40余篇，授权发明专利4项。并与公司合作，转化科技成果2项，形成了生殖行业领先的产品2项。