案例经过
仲夏的早晨，笔者拆开一个来自疾控中心的信封，里面掉出一份HIV抗体确证报告。上面几个鲜红的字体，甚是醒目——“HIV抗体不确定”。
HIV抗体确证报告（局部）
再一细看，笔者回想起，这是一名老年男性，因“胆囊结石”入住外科。入院后传染病检测结果显示，安图A2000plusHIV抗体试剂S/Co=29.0（S/Co≥1.00为“有反应”）。
随后，使用罗氏ElecsysHIV抗原抗体联合试剂复查，S/Co=45.6（S/Co≥0.90为“有反应”）。同时，采用英科新创HIV抗体胶体金试纸复查，结果也是“有反应”（但条带显色较弱）。
三种不同原理的初筛实验，都呈现有反应，检测信号值也都不低。我们觉得，HIV感染应该是没跑了。不过按照检测规程，他的血样还要送到疾控中心，做免疫印迹（WB）试验——也就是HIV抗体确证试验。
但查询他的检验结果时，我们却意外发现，在两周前，他曾因“乏力、2型糖尿病”，入住我院内分泌科，当时却是HIV“阴性”（S/Co=0.01，安图A2000plus）。难道他恰好处在HIV感染的窗口期！？
然而，过了几天，我们却收到一份“不确定”的确证报告——患者WB试验中，出现了gp160和p24条带，被判定为“HIV抗体 不确定”。
讨论
一.HIV流行率在我国仍然呈逐年升高趋势
我国HIV感染情况并不乐观，根据CDC数据，2012-2020年期间，艾滋病的新发例数和死亡人数双双逐年上升的趋势没有得到有效遏制，2020年全国HIV感染者高达62167例；艾滋病也是我国法定传染病死亡最高的病种，2020年死亡人数高达18819例[1]。
就笔者所在检验科来说，七年前，我们一年仅会出现个位数的阳性结果。而到去年，全年检出阳性标本近百例。
二、目前HIV诊断依赖于实验室检测
面对依然严峻的HIV流行情况，准确、及时诊断依赖于实验室检测。感染HIV后10天内，无法检测到任何病毒标志物，这一时段称为掩蔽期（eclipseperiod）。
之后，HIVRNA首先被测到，在短期内达到浓度峰值，而后回落并持续存在。RNA出现4-10天后，p24抗原出现，第4代HIV筛查试剂可同时检测抗体和p24抗原，因此可呈“阳性”结果。p24抗原出现3-5天后，IgM和IgG抗体相继出现，IgG往往终身存在[2]。
图：HIV感染初期病毒学标志物的动态学变化及检测试剂对应窗口期
病毒标志物都存在诊断的“窗口期”。第一代HIV试剂应用病毒裂解产物捕获HIV IgG抗体，灵敏度较低，窗口期为5周以上；第二代试剂使用重组蛋白或人工合成肽包被，检测IgG，提高了灵敏度和特异性，窗口期约为4周；第三代试剂同时检测IgG和IgM，窗口期缩短为3周左右；而第四代或第五代试剂还可检测p24抗原，窗口期进一步缩短为约2周。HIVRNA最早（约10天）被检测到。
现阶段，我国大部分地区对HIV感染的诊断，由HIV初筛试验及抗体“确证试验”（或称为“补充试验”）组成[3]。免疫印迹试验（westernblot，简称WB）是确证试验的主角，往往充当“终极裁判”的角色，感染者要得到明确诊断和免费抗病毒治疗，一般要有WB试验“阳性”的报告。
WB试验原理是将HIV裂解，病毒蛋白在纤维膜载体上电泳，根据蛋白分子量依次分布于膜的不同位置。若待测血清中存在HIV抗体，则与相应蛋白结合并显色，在膜相应位置显现条带。
图：HIV主要基因及蛋白
不同WB试剂的阳性判断结果有所不同。一般来说，若同时出现多条条带（如gp160/gp120和p24，或更多）为阳性；没有条带则为阴性；而当出现条带，又不满足阳性标准时，为“不确定”。
图：HIVWB条带与结果判定。左侧数字代表不同的分子量大小的蛋白。Neg：阴性；Pos或+：阳性；Ind：不确定；Controls：对照（WkPos：弱阳性对照，StrPos：强阳性对照）
三、现实世界中，WB存在诸多问题
1.WB“不确定”结果偏多
“不确定”结果可占到WB结果的4-20%[4]。造成不确定结果主要有两种情况：
第一种为感染早期阶段，HIV抗体水平不高，WB显色条带少且色浅，不足以判定为“阳性”。本文中患者的WB出现gp160和p24条带，被判读为“不确定”。然而，这两条带却高度提示处于HIV感染早期[5]。该患者HIV抗体筛查结果，在两周内由“阴”转“阳”，也证实这一点。这种“不确定”反映的是WB对诊断早期感染的灵敏度有限。
第二种为低危人群血清干扰物质，导致WB出现非特异性显色条带，结果“不确定”。孕妇、自身免疫病患者、淋巴瘤患者等人群，HIV抗体初筛试验容易呈现“弱阳性”，流行病学史并不支持HIV感染，但送样至CDC经WB确认，却可能得到一份HIV抗体“不确定”的报告，被检测者徒增精神负担的同时，其后续诊治也可能受阻，给被检测者造成很大困扰。这种“不确定”反映的是WB诊断HIV感染的特异性有限。
2.WB结果判读缺乏统一标准
影响WB结果的变量较多。不同生产技术、不同品牌WB试剂的结果判断标准不同，不同学术组织判断标准也有所差别（见下表），
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组织 |
WB判断标准 |
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世界卫生组织（WHO） |
两条env蛋白条带，伴或不伴gag或pol蛋白条带 |
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美国公共卫生实验室（APHL）/美国CDC |
任意两个条带: p24, gp41, gp120/160 |
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美国红十字会（ARC） |
三条或更多条带, 其中一条来自于gag，pol或env蛋白 |
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逆转录病毒血清学标准化协会（CRSS） |
两条或更多: p24 或 p31 和 gp41 或gp120/160 |
面对模棱两可的条带模式，操作者往往一筹莫展，压力山大，出于怕给被检者扣上“HIV阳性”帽子的顾虑，不少操作者选择保守地发送“不确定”结果，让被检者继续随访，从而牺牲了诊断的灵敏度和时效性；另一面，明明知道被测者是低危人群，“弱阳性”的酶联免疫吸附试验或化学发光筛查结果，极有可能是非特异性免疫反应引起，理论上，这些非特异性同样可能引起WB条带显色，但谁也不敢轻易发送“阴性”WB结果，这样一来，“不确定”成了无奈的折中，降低了诊断特异性，同样影响诊断效率。
3.WB本身属于较为落伍的检验技术
从原理上讲，WB试验仅检测HIVIgG抗体，不能检测IgM抗体，属于第1代检测技术，灵敏度有限，窗口期较长，不能很好地早期诊断HIV感染[2,6]。WB也无法检测p24抗原。
从操作层面讲，WB手工操作繁琐、耗时，也无法实现全自动。与高通量、自动化、易于标准化的核酸检测和化学发光免疫检测相比，劣势明显。
4.现行WB报告流程周期过长
在现行HIV诊断体系下，大部分医院HIV初筛阳性样本需送至疾控中心，由疾控中心统一、批量进行WB，并出具确证报告。这一套流程下来，短则需要1到2周，长要近1个月。如此冗长的周期，对等待结果的患者是一种煎熬，
针对WB试验“不确定”结果，又建议2到4周后复测，周期进一步变长。对真正的HIV感染者，在感染早期，病毒载量高，传染力强；及时诊断、及时启动抗病毒治疗，可明显提高治疗应答率，并减少病毒传播。而遗憾的是，若沿用现有流程，则很难做到早发现、早诊断；另一方面，对很多非HIV感染的急症患者，面对“不确定”的WB结果，是一种身体和精神的煎熬。
此外，在我国现有HIV感染的诊疗体系下，诊断和治疗的重心在CDC。但一些HIV感染者，对于要将血样和身份信息送到CDC这样的要求，存在抵触甚至恐惧心理，拒绝配合完成。这导致他们长期无法得到明确诊断与治疗，也长期游离于HIV诊疗体系之外，自身无法得到及时的抗病毒治疗，以及也容易造成更多的疾病传播。
四、核酸检测时代已经到来
鉴于上述WB的局限性，美国CDC从2014年起，就不再推荐WB试验作为确证试验，而用RNA检测取而代之[7]。
类似地，美国CDC在前一年即推荐用HCVRNA替代HCV抗体确认试验，以确诊丙型肝炎。随着HCVRNA检测的推广，我国现阶段已经鲜有HCV抗体“确认”的临床需求。
病毒核酸检测的优势在于：
①缩短检测窗口期，提高急性感染诊断的灵敏度；
②特异性高，很少受“不确定”结果的困扰；
③更易实现检测的标准化，减少结果判断的主观性；
④可做筛查，可做确诊，同时是启动抗病毒治疗及监测抗病毒治疗疗效的指标。
众所周知，新冠疫情促进了全民“核酸检测”概念的普及，各级医院PCR实验室设备和人员配备趋于完善，这些客观上也为HIVRNA检测的推广奠定了基础。
从检验技术角度看，HIVRNA检测和HCVRNA、SARS-CoV-2RNA类似，并没有更高的技术门槛和研制成本。遗憾的是，目前HIVRNA价格远高于同类产品如HCVRNA和SARS-CoV-2RNA，做一次HIVRNA动辄上千元，阻碍了其推广应用。
结语
去年以来，面对突发的新冠疫情，我们国家采用非常手段、不因循守旧，才在短时间内控制、消灭了疫情。因此，对待HIV病毒——这一难缠的病魔——我们也只有不断与时俱进、及时更新诊疗理念与手段，才可能控制和战胜它。
我国更新的HIV指南或操作规范中，提升了HIV RNA检测的重要性，时至今日，以HIV RNA检测取代WB试验的时机已经成熟，灵敏、低价的HIV RNA试剂也是诊断市场的潜在需求。我们也建议，将HIV诊断与治疗的主体，从各级疾控中心逐步下放到各级医院，能对遏制HIV的流行发挥积极作用。在不到10年的时间里，我们要努力实现联合国提出的“2030年终结艾滋病流行”的目标，最终实现“天下无艾”，让全人类拥有光明的明天。
参考文献
【1】中国CDC官方数据
http://www.nhc.gov.cn/jkj/s3578/202103/f1a448b7df7d4760976fea6d55834966.shtml
【2】Saag MS. N Engl J Med. HIV Infection - Screening, Diagnosis, and Treatment.2021, 384:2131-2143.
【3】中国疾病预防控制中心，全国艾滋病检测技术规范（2020年修订版）
【4】Mary Louise Turgeon. Immunology and Serology.5th ed.2014,p336
【5】李楠, 缪礼锋. WB带型分析对HIV感染期和AIDS期的诊断意义. 中华疾病控制杂志, 2005，9:376-377.
【6】杨瑞锋，樊春红. 从“血清学阴性”HIV感染病例谈病毒抗体检测的局限性. 临床检验杂志.2018, 36: 285-287.
【7】CDC, Laboratory Testing for the Diagnosis of HIV Infection: Updated Recommendations,2014.